生物合成高能化學物質

陳子鵬，趙鈺沁，王宸，王秀秀，魏煒，趙勁,＊

1南京大學化學化工學院，南京 210023

2南京大學生命科學學院，南京 210023

2020年9月，習近平總書記在第75屆聯合國大會一般性辯論上提出，中國力爭2030年實現碳達峰，并努力爭取2060年前實現碳中和[1]，2021年的政府工作報告中，這一重大戰略決策再度被提及[2]。對于實現“碳中和”目標，生物合成技術的發展與應用起到不可或缺的作用[3]，與化學合成相比，生物合成可以實現從原料源頭上降低碳排放。生物合成依賴于各種酶，酶催化的反應轉化率高、反應條件溫和，并且生成產物的結構專一[4]，可以實現較好的原子經濟性，并降低能耗[5]。目前，世界上主要的能源供應來源于化石燃料，其他高能物質的生產也依賴于化學合成，污染高，碳排放量大。然而，研究人員發現，自然界中存在可以合成能源物質、含能材料的生物，并已經破解出相當一部分生物合成途徑[6,7]，這將為人們更好地應用生物合成技術實現節能減排指明方向。

本文將從能源物質、含能材料和天然高能物質三個方面入手，選取氫氣、丁三醇、氧化偶氮化合物和多聚磷酸鹽幾種代表性高能物質，分析討論它們的生物合成途徑以及與之相關的關鍵金屬酶。

1 能源物質的生物合成——氫氣

能源物質中，氫氣是當之無愧的清潔能源，但基于裂解水的制氫技術耗能較高，并且設備容易腐蝕，基于石油/煤化工的制氫技術碳排放高[8]，幸運的是，自然界中存在具有產氫能力的氫化酶(Hydrogenase)，對這類酶的研究為制氫工業開辟了一條新的道路。

氫化酶是金屬酶，根據其金屬離子的不同可分為[Fe]氫化酶、[NiFe]氫化酶和[FeFe]氫化酶三種[9]。[Fe]氫化酶是一種不含鐵硫簇的氫化酶，具有FeGP輔因子，這種酶存在于產甲烷菌中，可逆地催化methenyltetrahydromethanopterin(methenyl-H4MPT+)與氫氣反應，產生methenyl-H4MPT和一個質子(圖1)[10-13]，Methenyl-H4MPT+是產甲烷菌的一個甲基轉移中間體，這一反應是產甲烷菌中將CO2還原成CH4代謝通路的中間環節，該反應的順利進行維系了產甲烷菌的能量代謝過程。

圖1 (a)[Fe]氫化酶的晶體結構(PDBID:3DAG)[10]；(b)FeGP輔因子；(c)[Fe]氫化酶所催化的可逆產氫反應[13]

[FeFe]氫化酶和[NiFe]氫化酶具有鐵硫簇，[FeFe]氫化酶還具有H簇(圖2a)[14,15]。[FeFe]氫化酶存在于厭氧菌中，目前Stripp課題組[16]已闡明其產氫的質子傳遞機理，即當缺乏天然發色團的高活性鐵硫酶經過光還原后，活性位點輔助因子(H簇)的堿度增強，引發了不連續質子轉移(圖2b)。

圖2 (a)[FeFe]氫化酶的結構(PDBID:3C8Y)[15]；(b)[FeFe]氫化酶中與質子遷移相關的氨基酸殘基與輔基[16]

[NiFe]氫化酶存在于細菌和古菌中，這種氫化酶更偏向于將氫氣裂解為質子與氫負離子[17,18]。大腸桿菌中也存在[NiFe]氫化酶，這種酶屬于FHL復合體，是大腸桿菌厭氧發酵物產生氫氣的來源(圖3)[19]。

圖3 (a)[NiFe]氫化酶的活性位點[10]；(b)FHL復合體的結構[19]

在氫化酶產氫的研究實踐中，研究人員通常將氫化酶與無機催化劑聯用，構建生物-無機雜化催化體系(Bio-inorganic hybrid catalytic system)，從而提高酶的產氫效率[20]。由于半導體具有本多-藤島效應[21]，研究人員常將半導體與氫化酶聯用，構建半人工光合體系，例如Honda團隊[22]通過在大腸桿菌中表達[FeFe]氫化酶同時外加納米TiO2實現了產氫，浙江大學唐?？祱F隊[23]以綠藻為產氫底盤生物，通過向綠藻中加入無定形SiO2引起綠藻硅礦化聚集成生物小球，并加入WO3引發氫氣產生，南京大學趙勁和魏煒團隊[24]通過在大腸桿菌表面展示PbrR金屬蛋白使之原位合成CdS半導體量子點并同時表達氫化酶Hya，從而實現大腸桿菌光催化產氫。上海交通大學樊春海院士團隊[25]通過外加Mg(OH)2誘導綠藻聚集，實現長期連續產氫。電催化是制氫的常用策略，也有研究人員將電極或電催化劑與氫化酶聯用，促進產氫[26,27]。

同時，研究人員也不斷嘗試對產氫酶進行人工改造，或嘗試模擬氫化酶的結構設計新型產氫催化劑。潘惠杰等[28]模擬[Fe]氫化酶的結構，設計了一種新型Mn配合物催化劑，吳驪珠院士團隊[29]模仿[NiFe]氫化酶的活性中心，構建了一種NiRu-RuNi二聚體金屬簇催化劑。Armstrong團隊[30]通過將[NiFe]氫化酶口袋中的半胱氨酸替換成硒代半胱氨酸，大大提升了氫化酶的催化效率和氧氣耐受能力。

隨著生物產氫研究的不斷深入，人們對氫化酶的理解不斷加深，將極大促進生物產氫從實驗室走向工業界的轉變。特別是生物-無機雜化催化體系的應用，將推動產氫技術不斷向低能耗與低污染前進。

2 含能材料的生物合成——1,2,4-丁三醇和氧化偶氮化合物

含能材料(Energetic materials)是指一種或多種化合物，具有易燃或易爆官能團，會劇烈氧化釋放大量能量和遠超自身體積的氣體[31]。含能材料在民間及軍事上存在很多用途，但其生產主要依賴化學合成[32]，如著名的梯恩梯炸藥(三硝基甲苯，TNT)、黑索金炸藥(環三亞甲基三硝胺，RDX)和奧托金炸藥(環四亞甲基四硝胺，HMX)的生產，需要消耗大量硫酸、硝酸對底物進行硝化，生產過程的危險性較高。近年來隨著生物合成技術的發展，含能材料的生物合成也正在啟動。

2.1 丁三醇及衍生物

1,2,4-丁三醇(Butane-1,2,4-triol，BT)是一種具有極高價值的有機合成中間體，尤其是其可以作為高能燃料和炸藥的前體物質。其硝化產物1,2,4-丁基三硝酸酯(BTTN)具有低溫力學性、沖擊穩定性和使用安全性等特點，在武器固體推進劑和發射藥配方中有著極其重要的作用，被視為傳統硝酸甘油的理想替代品[33-38]。諾貝爾發明炸藥以來，硝化甘油一直在工業和各種含能材料中占主要地位[36]。因此，為了實現這一“替代”，BT得到了國內外科研工作者的普遍關注。

目前BT的工業化生產主要采用NaBH4還原蘋果酸二酯、Rb/C催化蘋果酸加氫、馬來酸二乙酯/Cu/Cr催化加氫等化學合成[39,40]。這些方法的工藝條件苛刻，且采用的高壓催化加氫等相對危險，合成過程中涉及到的汞鹽和大量酸性溶劑會對環境有極大的污染。反應條件溫和、安全系數高、對環境友好的生物合成法成為當下的研究熱點。

自然界中暫時還未發現天然的BT生物合成途徑[36]，但通過合成生物學方法對天然微生物進行改造，BT的生物合成得以實現。2003年，Frost團隊首次報道利用假單胞桿菌和大腸桿菌兩種微生物，以木糖和阿拉伯糖為底物，經四步酶促反應合成BT[36](圖4)。

圖4 四步酶促法合成BT[36]

迄今為止，以木糖為底物的四步酶促反應法仍是最高效的BT生物合成途徑[41]。現研究人員將BT合成的4個關鍵酶基因在大腸桿菌中進行表達，大大簡化了流程工藝[34]。但常用的大腸桿菌宿主存在嚴重的碳代謝抑制(CCR)，限制了工程菌在混合糖下生長和合成BT[41]，相比而言，克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)由于其生長速度更快，對混合糖的利用率更高[42,43,44]，可以作為優化生物合成途徑的首選菌株。其他優化手段還包括：(1)敲除旁路基因，抑制分支反應；(2)過表達關鍵酶；(3)引入分子伴侶蛋白GroES等進行輔助折疊；(4)采用反義RNA微調木糖代謝流以及弱化葡萄糖效應。經過深入研究，確定了四步反應的限速步驟為脫羧步驟，并以優化該步的酶菌為重點，使得MDLC、KDCA、kivD等都較過去的催化酶而言有不同程度的提升[45]。此外，底物濃度、誘導溫度、誘導時機也都有一定的影響，通過篩選條件進行適度優化，提高BT生產效率。

2.2 氧化偶氮化合物

氧化偶氮化合物(Azoxy compound)是另一類重要的含能材料，這種含能材料中含有氧化偶氮鍵(azoxy bond，圖5a)，可作為高爆炸藥使用。氧化偶氮鍵的引入可以提高含能材料的密度，并增加含能材料的穩定性，使材料的運輸、使用更加安全[32,46]。其中，代表性的化合物為4,4’-二氨基-3,3’-氧化偶氮呋咱(3,3’-diamino-4,4’-azoxyfurazan，DAOAF)和4,4’-二硝基-3,3’-氧化偶氮呋咱(3,3’-dinitro-4,4’-azoxyfurazan，DNOAF)(圖5b，5c)[46-48]。這兩種化合物及其衍生物構成了主要的氧化偶氮基含能材料[32,48-50]。

圖5 (a)氧化偶氮鍵；(b)DAOAF；(c)DNOAF

除了可用作含能材料外，氧化偶氮化合物還有許多其他功能，例如苯基氧化偶氮化合物可作為液晶材料使用[51]。然而，用作高能材料或液晶材料的氧化偶氮化合物幾乎完全依賴化學手段進行合成，經典的合成方法是，使用OXONETM氧化劑或者H2O2氧化前體中的氨基，并使之形成氧化偶氮鍵[52-55]。近年來，通過電化學催化將硝基苯衍生物氧化成氧化偶氮鍵的方法也層出不窮[56,57]。

氧化偶氮化合物除了可以通過人工化學合成獲取外，部分天然產物中也含有氧化偶氮結構基元[58]，這些天然產物具有諸如抗菌、抗癌等生物活性，而它們的合成途徑目前沒有完全破解。浙江大學李永泉團隊[59]在氧化偶氮化合物生物合成途徑的研究中做出了重要的貢獻，他們對苯基氧化偶氮類天然產物——氧化偶氮霉素的生物合成途徑進行了系統性的研究，并挖掘出了關鍵的金屬酶。

氧化偶氮霉素(Azoxymycins)是李永泉課題組在恰塔努加鏈霉菌L10(Streptomyces Chattanoogensis L10)培養物中分離出的含有氧化偶氮鍵的新型天然產物，分A、B和C三種，通過多維核磁、同位素取代、液相色譜、質譜與紫外光譜法確定了這三種天然產物的結構(圖6)。鑒于氧化偶氮霉素中含有苯多烯結構，研究人員推定合成途徑中可能存在與酮合成酶AsuC13/14同源的酶，并通過Native BLAST分析了S.Chattanoogensis L10的基因組序列，給出了推定的氧化偶氮霉素合成基因簇(圖7)[59]。

圖6 氧化偶氮霉素A、B、C的結構[58]

圖7 氧化偶氮霉素合成基因簇

深入研究發現，在敲除azoC基因后，培養物中會積累氧化偶氮霉素的苯胺前體產物，因此研究人員推定，AzoC酶是形成氧化偶氮鍵的關鍵酶。通過體外實驗發現，AzoC酶可以催化包括氧化偶氮霉素前體的一系列苯胺衍生物形成氧化偶氮鍵，由此，AzoC酶的功能獲得證實。通過生物信息學分析與同源建模發現，AzoC是一種與N-加氧酶AurF[60]和CmlI[61]高度同源的非血紅素雙鐵離子加氧酶，它們同時具有兩個EX28-37DEXXH鐵離子結合結構域(圖8)[62]。氧化偶氮霉素合成途徑與關鍵金屬酶的發現，為其他氧化偶氮天然產物合成途徑的解析提供了思路，也為氧化偶氮含能材料的生物合成奠定了基礎。

圖8 AzoC同源建模結構，示鐵離子結合結構域[61]

生物合成含能材料仍有許多基礎理論亟待突破，目前含能材料的化學合成仍作為主要合成方式，伴隨著越來越多的生物合成途徑的發現，人們將在未來逐步實現以更清潔、更高效的生物方法合成含能材料。

3 天然高能物質的生物合成——ATP和PolyP

與前述高能物質不同，天然高能物質指的是含有高能鍵的物質，如三磷酸腺苷ATP。此處“高能鍵”并不是物理化學中所描述的鍵能高、強度大的化學鍵，而是指在生物化學反應中能釋放出大量能量的化學鍵，例如ATP中連接γ-磷酸的高能磷酸二酯鍵。普通磷酸酯水解只能釋放出8-16 kJ·mol-1的能量，而ATP中γ-磷酸水解時高能磷酸鍵的斷裂可釋放33-54 kJ·mol-1的能量[63]。

多聚磷酸鹽(Polyphosphate，PolyP)是一種由正磷酸鹽殘基與高能磷氧鍵組成的結構最為緊湊的生物大分子，是一種廣泛存在于生物體胞內的、進化上高度保守的儲能高分子材料。根據多聚磷酸鹽對各類生物生命活動的重要意義[64-66]，可將其分為兩大類，即焦磷酸鹽和大分子聚磷酸鹽[65]。

一個大分子的聚磷酸鹽中含有三個甚至幾百個磷酸殘基，其功能和代謝方式也與焦磷酸鹽有著明顯的區別[65]。1990年，諾貝爾化學獎得主Kornberg團隊[67,68]首次發現并報道了細菌中的PolyP合成酶——多聚磷酸鹽激酶(Polyphosphate kinase,PPK)，這一發現使從基因水平操縱生物體內PolyP的合成成為現實。該團隊繼而開發了多種關于PolyP的檢測和定量方法[69,70]，為系統性研究PolyP在生物生理活動中的作用做出了巨大貢獻。2005年，PPK的結構首次得到確定，通過X射線晶體學方法可知，PPK是一種以Mg2+為輔因子的二聚體金屬酶(圖9)[71]。

圖9 PPK晶體結構(PDBID:1XDO)[70]

當下對聚磷微生物的了解大部分來自污水處理工程中強化生物除磷系統(Enhanced biological phosphorus removal,EBPR)的廣泛研究[72]，這為PolyP的生物合成路徑提供了靈感。南京大學楊柳燕團隊利用合成生物學技術，采用導入單個ppk1基因過表達中拷貝質粒的策略，構建了一系列工程菌，可通過富集富磷水中的磷元素來制備高聚合度的PolyP，磷元素回收率大于95%[73]。此外，近期也有報道稱可利用釀酒酵母合成水溶性的食品級的PolyP[74-76]，但關于vtc1-vtc4基因產物在PolyP合成中的酶活性尚在探索當中[77]，幸運的是，VTC復合體的結構已經解析，VTC-PolyP復合體的結構也已經獲取(圖10)[78]，這對理解PolyP的生物功能、促進PolyP合成工業的發展具有重大意義。

圖10 VTC-PolyP復合體結構(PDBID:3G3Q)[77]

與化學合成的低聚合度多聚磷酸鹽(鏈長＜20 Pi)不同，生物合成的多聚磷酸鹽聚合度更高(20 Pi＜鏈長＜700 Pi)，單位負電荷密度更高[73,77]，更具功能性與特征性。南京大學趙勁與魏煒團隊[79]發現，PolyP可與細胞中的強正電蛋白質結合并引發相分離現象，意味著PolyP具有未知的生物調控功能。現在科學家已通過實驗表明：PolyP能夠與帶正電荷的聚合物(如：海藻酸、透明質酸)、無機陽離子(如：Ca2+、Mg2+、Sr2+)或基本有機成分(如：氨基酸、多胺、多肽、蛋白質)相互作用，加工成水凝膠或納米顆粒，用于人工骨修復材料和其他生物醫學應用[80,81]。

以聚磷酸鹽為代表的天然高能產物，其生物功能仍有許多未解之謎。天然高能物質的生物合成的發展，將大大降低這些物質的獲取難度與生產成本，為破解這些科學問題提供物質基礎，同時也將為人們提供一批新型的天然高分子材料，助力人類重大疾病的攻克。

4 展望

進入21世紀以來，生物合成技術雖然得到了長足的發展，但距離以生物合成替代化學合成工業還有著很長的路要走，在高能物質生物合成領域，不少生物合成途徑仍等待破解，工業化生產也亟待突破。目前的瓶頸在于：生物合成能替代的化學合成技術太少，不足以應對高能化學物質的需求；生物合成成本還較高，需要發展高效的工藝；由于合成生物學和能源物質結合剛剛起步，很多應用場景還需要拓展。這些挑戰需要我們在未來將基礎研究與應用發展并重，并通過生物合成途徑的基礎研究來促進工業轉化，用更高效的酶和更簡捷的路線來實現更高的產能。

隨著人們對環境友好型產業的期待，以及國家對綠色生物合成技術發展的重視，在可預見的未來，生物合成高能物質必將成為中國乃至世界范圍內能源結構的重要組成部分，對人類未來能源獲取和轉化方式產生深刻影響。