微量元素銅與人體生理功能和疾病

向思佳，劉揚中

中國科學技術大學化學與材料科學學院，合肥 230026

銅是生物體必不可少的微量元素，成人體內含有100-200 mg銅，是僅次于鐵和鋅的第三微量元素。銅的價態通常是+1價和+2價，在細胞中銅不會以自由離子形式存在。細胞內的銅處于一個相對穩定的狀態，其中銅轉運蛋白(hCtr1)的銅攝取和ATP酶(ATPase)的銅外排對維持胞內銅的正常水平起到至關重要的作用。當銅缺少或過量時，就會導致疾病的產生甚至是威脅生命；另外，利用關鍵蛋白對銅的依賴性，可以通過調控體內銅的水平進行癌癥等疾病的治療。本文從銅的配位結構、相關蛋白功能對相關問題進行闡述。

1 銅的配位化學

Cu的價層電子結構為3d94s2，所以通常呈現出的價態為+1價(3d10)和+2價(3d9)。不同價態的銅可以形成不同的配位結構，一價銅通常形成線性、平面三角形或四面體的結構；而二價銅則通常形成平面四邊形、四角錐或八面體。根據軟硬酸堿的概念，Cu(I)屬于軟酸，而Cu(II)屬于中間態酸。根據軟硬酸堿理論，軟酸與軟堿或硬酸與硬堿具有較強的親和性。因此，Cu(I)更傾向于與半胱氨酸、蛋氨酸配位，而Cu(II)則傾向于與組氨酸配位。這些配位性質使得銅在蛋白質中有著三種特征配位方式：

(1)以四面體作為配位結構的I型銅(圖1a)：最常見的是His2CysMet，其具有相對高的還原電勢，600 nm附近強吸收，通常與電子傳遞相關。質體藍素便是屬于這一類銅蛋白。

(2)以平面四邊形為配位結構的II型銅(圖1b)：通常與N或N/O配位。銅鋅超氧化物歧化酶，多巴胺氧化酶都是屬于這一類的銅蛋白。

(3)以雙核銅為配位結構的III型銅(圖1c)：配位原子為(His)3Cu-X-Cu(His)3，兩個Cu通過橋聯原子共價偶合重疊，常見于氧化酶或O2運輸蛋白。血藍蛋白、酪氨酸酶便是屬于這一類銅蛋白。

圖1 銅蛋白中三種典型的Cu(II)配位結構

2 人體中重要的銅蛋白

人體中部分蛋白質依賴于銅的配位而發揮其正常功能，這類蛋白就是銅蛋白。下面介紹幾種重要的銅蛋白。

2.1 血漿銅藍蛋白(CP)

血漿銅藍蛋白由肝臟細胞制造，核心位置包含六個銅離子，在星形膠質細胞中表達的CP是以GPI錨定形式存在的，主要作用是進行鐵和銅的氧化還原反應，反應時二價銅離子還原成一價，而把鐵離子由二價氧化成三價，并協助轉鐵蛋白運輸鐵[1]，屬于亞鐵氧化酶。

CP-轉鐵蛋白系統是細胞內鐵的主要輸出途徑，血漿中的CP可以利用其亞鐵氧化酶活性將Fe2+氧化成能與轉鐵蛋白結合的Fe3+，Fe3+結合轉鐵蛋白后被轉運至靶細胞，經內吞后進行代謝或者儲存。結合了銅的CP是血清中銅的主要載體，其攜帶了血漿中95%的銅，所以可以作為銅含量的指示物，即通過測定CP含量來判斷機體中銅的含量，進而診斷某些肝、膽、腎疾病。當銅藍蛋白到達靶細胞表面時，會與其相應的受體相互作用釋放銅，這些銅會被靶細胞吸收和利用，通過CP對銅離子的結合和釋放，可以實現銅在不同的組織器官中有不同的分布。

當銅藍蛋白缺乏，或由于基因突變導致其亞鐵氧化酶活性喪失，如遺傳性銅藍蛋白缺乏癥，會使Fe2+無法氧化成Fe3+，進而不能與鐵轉運蛋白結合而進行鐵的輸出，引發缺鐵性貧血，同時也會導致神經系統中Fe2+大量沉積和Fe3+缺乏，從而引起神經系統退行性疾病[2]。

2.2 細胞色素C氧化酶(CCO)

細胞色素C氧化酶作為二聚體線粒體膜蛋白靠近線粒體內膜，是一種電子轉移蛋白，在生物體的氧化呼吸鏈中，能將電子傳遞給氧氣生成水，且能實現質子的跨膜轉移[3]。作為一種跨膜蛋白，通過α螺旋貫穿線粒體內膜，而在膜內或膜外則是充滿α螺旋和β折疊結構。細胞色素C氧化酶的金屬離子中心由3Cu、2Fe構成，兩個Fe通過卟啉環配位構成了細胞色素a和細胞色素a3，兩者結合緊密，不可分開；而三個Cu則是構成了一個雙核CuA中心和一個單核CuB中心。

細胞色素C氧化酶在電子轉移過程中會發生反應：

電子轉移途徑為：

CytC → CuA→ Cytochrome a → Cytochrome a3-CuB→ O2

銅是細胞色素C氧化酶中重要的金屬中心，當銅缺乏時，細胞色素C氧化酶的活性會被抑制，從而使氧化呼吸鏈無法正常進行，機體無法正常產生能量。

2.3 銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)

催化機理為:

SOD的金屬中心含有Zn和Cu兩種金屬離子，其中Zn主要是起到結構穩定的作用，而Cu則主要起到催化作用，這一點從機理上也可以看出。由于人體內在或外界的因素，會造成機體、皮膚組織的自由基導致皮膚的衰老，SOD可以消除氧自由基，從而抑制或緩解機體的衰老；此外，氧自由基會導致脂質過氧化物積累，引起動脈粥樣硬化等疾病，因此SOD對高血脂引起的心腦血管疾病有預防作用；同時，SOD對于各類自身免疫性疾病都有一定的療效，如紅斑狼瘡、硬皮病、皮肌炎等[4]。

3 銅的攝取、調控和代謝

3.1 銅的攝取

銅首先由腸上皮細胞(IECs)攝取，進入細胞后結合于Cu相關蛋白質，通過腸側膜進入外周循環。隨后銅被輸送到肝臟，在這個維持銅穩態的中樞器官中，銅被肝細胞整合到分泌的血漿銅藍蛋白(CP)中，該酶可催化血清中亞鐵氧化成三價鐵，使其能夠與轉鐵蛋白結合，從而實現鐵離子的細胞攝取[5]。下面具體介紹哺乳動物中銅離子的細胞攝取過程。

銅轉運蛋白(Ctr1)承擔起了跨膜運輸銅的重任：人類銅轉運蛋白(簡稱hCtr1)是由190個氨基酸殘基構成的三跨膜蛋白，N-端在膜的外側，C-端在膜的內側，N-端有組氨酸富集和蛋氨酸富集的基序各兩個[6]。通常hCtr1是由三聚體的模式聚合，在高分辨率的電鏡下可以觀測到對稱的通道狀三聚體，形成了一個“離子選擇過濾器”，選擇性攝取Cu+離子。Ctr1膜外N-端的金屬結合域捕獲Cu+離子，Cu(I)通過Cu-S鍵配位結合于hCtr1，通過通道內的金屬配位氨基酸進入細胞[7]。通過突變或截短hCtr1序列發現，N-端、C-端的金屬結合域均對銅的攝取有影響[8]。

有趣的是，除了Cu可以利用Ctr1被細胞攝取，一些金屬藥物也可以利用Ctr1，如順鉑就是利用了銅轉運蛋白hCtr1進入細胞中從而起到誘導腫瘤細胞凋亡的作用。

3.2 銅的胞內組裝

銅進入細胞后與銅伴侶蛋白結合，并被組裝到功能蛋白中，以防止游離的銅離子催化胞內生物分子氧化，產生活性氧(ROS)。如SOD發揮酶的功能需要銅離子，但細胞內并不存在自由的銅離子，所以需要利用伴侶蛋白提供銅離子，促使SOD成熟。伴侶蛋白為細胞內金屬離子運輸、分配、平衡起到重要的作用，這一轉運體系受損可能導致疾病的發生。下面介紹三種經典的銅伴侶蛋白。

3.2.1 CCS：銅鋅-超氧化物歧化酶的銅伴侶蛋白

CCS蛋白(Copper Chaperone for Superoxide Dismutase)，是第一個被發現的銅伴侶蛋白，在哺乳動物細胞和酵母細胞內為SOD蛋白提供銅離子。酵母細胞實驗表明，敲除yCCS不影響細胞中Cu和SOD蛋白的含量，但會降低細胞內SOD蛋白的活性；而通過體外實驗發現自由的Cu2+離子(Cu-GSH)可以激活SOD，銅螯合劑BCS(bathocuproine sulfonate)能夠抑制Cu-GSH的作用；但Cu-CCS可以激活SOD且不受BCS影響。根據配位結合常數計算表明，細胞的自由銅離子濃度不會超過10-18mol·L-1，如果一個細胞內含有一個銅離子，則濃度為10-10mol·L-1，因此細胞內不存在自由的銅離子。同時這一結果也說明了CCS對激活SOD的必要性[9]。

3.2.2 Atox1：ATPase的銅伴侶蛋白

Atox1由68個氨基酸殘基組成，有兩個保守序列：一個是金屬結合位點，另一個是核定位信號。Cu的配位可以通過Cys-Cu(I)使蛋白二聚：如果二聚的蛋白是兩個Atox1，通過其上的核定位信號介導蛋白質由細胞質向細胞核內轉運，在細胞核內，Atox1可以作為cyclin D1的轉錄因子，激活CCND1的啟動子，進而促進CCND1的表達，其可以通過激活CDK激酶蛋白，在細胞周期中起調控作用[10]；如果二聚的蛋白是一個Atox1和一個ATPase，Cu(I)可以通過改變與其結合的Cys-Cu(I)共價鍵，從而將Cu(I)從Atox1傳遞給ATPase。ATPase就是ATP酶，可以催化水解ATP成ADP和Pi，也可以作為一種銅轉運體，將銅運出或運進細胞。

銅轉運型ATPase分為ATP7A和ATP7B兩種。ATP7A存在于肝臟之外的多數細胞中，ATP7A在小腸中幫助細胞攝取銅。其他細胞中的ATP7A具有雙重功能，通常存在于高爾基體中的ATP7A為酶、骨、發、神經系統等提供銅；當細胞內銅過多時，ATP7A蛋白會離開高爾基體，轉移至細胞膜，將銅泵出細胞。門克斯病(Menkes disease)是一種罕見的基因疾病，由于ATP7A突變導致小腸的銅吸收受阻，患者體內多種生理功能無法進行[11]。而ATP7B主要存在于肝臟，少量在腎、大腦中。在肝臟中，ATP7B通常存在于高爾基體，為血漿銅藍蛋白提供銅，再通過血液轉運至其他組織；當肝臟銅過多時，ATP7B蛋白離開高爾基體，將銅泵出至囊泡，通過膽汁排出。如果ATP7B基因突變，會導致肝豆狀核變性疾病(又稱威爾遜病，Wilson disease)，細胞內銅分配不正常，使得銅過量[12]。因此，Atox1作為一種伴侶蛋白，對于銅在細胞中的整體分布起到至關重要的作用。

3.2.3 Cox17：細胞色素C氧化酶的銅伴侶蛋白

在真菌中，首次發現了Cox17是細胞色素氧化酶功能所必須的，是一種富含半胱氨酸的蛋白質，之后研究發現，在哺乳動物中同樣需要Cox17，這是激活細胞色素C氧化酶(CCO)、促進胚胎發育所必需的蛋白質[13]。Cox17中6個Cys都是銅的結合位點，完全氧化的時候形成3個二硫鍵，不能結合金屬，部分氧化的Cox17有2個二硫鍵，可以結合1個Cu+離子，而還原態的Cox17沒有二硫鍵，可以與4個Cu+離子協同結合，形成多核Cu(I)簇[14]。

Cu通過Cox17運輸到線粒體，在額外的蛋白質(如SCOs和Cox17)的幫助下，Cu并入細胞色素C氧化酶。我們在研究中發現，Cox17還可以將抗腫瘤藥物順鉑傳遞至線粒體，這一過程對順鉑促進細胞凋亡的藥效具有重要的貢獻。有趣的是，Cox17對順鉑的結合具有選擇性。

3.3 銅的調控

由于銅的不可控積累可能會導致氧化應激或者與大分子結合不恰當，所以需要對銅的攝取、分布和使用進行嚴格的穩態調控。這里主要介紹銅攝取調控。

前文提到人體銅的攝取是通過銅轉運蛋白hCtr1實現的，所以可以通過調節hCtr1的表達來控制銅的攝取。而hCtr1的表達則是由轉錄因子Sp1調控的：當胞內Cu不足時，Sp1會與hCtr1的啟動子結合，增強hCtr1的表達，同時也能與Sp1的啟動子結合，增強Sp1的表達，作為一種正反饋產生更多的hCtr1，促進Cu的攝取；當胞內Cu過量的時候，過量的Cu會取代Sp1鋅指結構中的鋅，改變Sp1的結構，破壞了Sp1對hCtr1啟動子的識別，從而停止了Sp1和hCtr1的轉錄表達，從而使細胞對銅的攝取減弱，使細胞內銅水平降低[15]。而人體銅的排出則是通過ATPase實現的，當銅過量時，ATPase可以將Cu泵出細胞外，從而對細胞內銅的含量起到調控的作用。

4 銅與疾病

4.1 銅缺乏癥

Menkes disease是一種罕見的伴X隱性遺傳性疾病，病患兒出生時正常但多在2-4個月后就會開始出現嚴重的神經系統退化表現，平均生存年齡僅1.8歲，經組氨酸銅治療可明顯改善[11]。ATP7A的活性缺失導致銅不能從腸上皮細胞進入血液，因此以銅缺乏為特征。

銅缺乏的第一個臨床表現是貧血；銅缺乏的下一階段可能涉及結締組織缺陷，甚至減少骨密度，而在銅缺乏癥晚期，除了全血細胞減少外，還會有嚴重的神經病變[16]。由于銅向大腦的傳遞減少，Menkes disease患者會表現出嚴重的精神和發育障礙，部分原因是由于銅依賴性酶的活性降低，除了嚴重的進行性神經變性外，Menkes disease的臨床特征還包括結締組織異常，肌張力減退和皮膚和頭發色素沉著減退。

線粒體功能受損是Menkes disease導致嚴重大腦損傷的主要因素。在Menkes disease病患者的腦中觀察到細胞色素C氧化酶活性缺乏，大腦乳酸水平升高以及n-乙酰天冬氨酸含量降低，它們的合成與神經元線粒體能量的產生相關聯，如此的變化可以作為線粒體氧化磷酸化失敗的進一步指標。

注射給藥給予銅化合物用于治療Menkes disease可以改善臨床結果，但至少要在新生兒出生后不久就開始治療。而具有剩余ATP7A活性的Menkes disease新生兒比完全喪失功能的新生兒更容易對這種治療做出反應，因此，恢復至少低水平功能的ATP7A的基因治療可能成為一種代替的治療方案[17]。

4.2 銅過量癥

Wilson disease是一種以青少年為主的常染色體隱性遺傳病，通常伴隨與肝臟、眼、神經相關的癥狀，起源于銅運輸ATP酶——ATP7B的遺傳缺陷。由于ATP7B功能受損，銅不能從肝細胞分泌到膽汁并在肝臟和其他組織中積累，導致惡性、嘔吐和腹瀉等急性腸胃道癥狀，并產生慢性銅毒性。大約一半的Wilson disease患者會出現中樞神經系統毒性，而神經節和大腦協調運動的其他部分也可能會受到影響，產生運動障礙[16]。研究發現，患者通常會產生異常的星形膠質細胞即阿爾茲海默病I型和II型細胞，這可以作為Wilson disease典型的神經病理特征。

Wilson disease的治療通常采用D-青霉胺或三乙基四曲胺等銅螯合劑進行治療，以恢復和維持體內的銅穩態[17]。青霉胺是一種還原性螯合劑，其還原步驟可以降低銅對蛋白質的親和力，使其更有效地被螯合，但青霉胺也有嚴重的副作用，會導致血液學或腎臟毒性。而對于未出現癥狀的患者，可以通過鋅治療，鋅可以誘導腸道金屬硫蛋白(MT)的合成而使機體缺銅，MT蛋白對于銅有很高的親和力，并形成一種銅-蛋白復合物，這種銅復合物不能被吸收，并通過糞便排出，由于鋅的毒副作用相對較低，它已經成為了Wilson disease病維持治療的首選藥物[16]。

4.3 銅與腫瘤

由于銅是許多必需酶的關鍵成分，為了滿足腫瘤細胞快速增殖對銅的需求，癌癥組織和癌癥患者的血清銅水平升高。癌癥的進展包括不受控制的細胞生長，隨后是癌細胞的侵襲、傳播和繼發性腫瘤的形成。如果腫瘤生長得大于幾毫米，就需要血管生成。銅對腫瘤的影響可以通過影響幾種誘導促血管生成反應的分子途徑，包括與血管生成因子的直接結合并促進他們的表達；也可以通過激活代謝來影響癌細胞的轉移能力[18]。

研究發現，在惡性組織中，平均銅濃度比正常組織高出46%，尤其是在大腸、胃、膀胱和女性生殖器官中尤為明顯。自由基，特別是超氧化物自由基離子被認為是癌癥的可能原因。Cu水平顯著增強會促進銅在線粒體中介導的催化作用，從而導致活性氧(ROS)的生成，過量的ROS會導致蛋白質的氨基酸側鏈被氧化或肽鏈斷裂從而改變蛋白質性質，導致各種酶活性的喪失；ROS可能氧化DNA的堿基或降解DNA；此外，ROS還可能作用于細胞膜的不飽和脂肪酸，造成脂質過氧化反應，破壞膜的正常功能[19]。這些過程都可能引發細胞生長狀態的改變，所以銅和腫瘤關系十分密切[20]。

銅在促進生理血管生成和惡性血管生成方面也發揮重要的作用。研究表明：實體腫瘤的生長和轉移能力依賴于血管的生成，而血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成的關鍵因子，且銅被發現參與了這樣一些在腫瘤血管生成中的因子的活性調節。由于腫瘤可以通過形成新血管使自身生長、侵襲和轉移，所以一種抑制腫瘤的抗癌方法就是降低銅的含量，一個很經典的藥物就是銅螯合劑四硫鉬酸鹽(TM)，其可以快速地螯合消耗銅，是一種有效的抗血管生成劑。TM有雙重的作用機制：在食物中加入可以使TM、銅和食物中的蛋白形成三方復合物，從而防止銅的吸收；在兩餐之間服用，TM被吸收到血液中，并與白蛋白以及血清銅形成三方復合物，這種絡合銅無法被細胞吸收，從而使得銅量迅速減少[16]。

銅螯合療法的優點之一是，它減少了許多因子的分泌，潛在地解決了血管生成的冗余問題，在炎癥性乳腺癌細胞系中，用銅螯合劑治療后，機體釋放的血管生長因子如VEGF、FGF、IL-6等水平顯著降低，與未治療的乳腺癌細胞培養基相比，血管生長顯著減少[21]。

最近的研究發現，Atox1具有與癌癥進展相關的轉錄活性。上文提到Atox1可以作為一種銅依賴轉錄因子促進細胞周期蛋白D1的表達，這是一種參與細胞周期和細胞增殖的關鍵蛋白[18]。最近發現，Atox1在乳腺癌中上調，細胞跟蹤顯示，在細胞中Atox1沉默后，細胞遷移速度和方向性顯著降低。結果表明Atox1通過ATP7A-LOX軸上的協調銅轉運體介導乳腺癌細胞的轉移。由于單個細胞遷移是乳腺癌轉移的早起步驟，腫瘤細胞中的Atox1水平可能是轉移潛力的預測指標。所以當細胞內銅含量降低時，可以抑制癌細胞的增殖與轉移[22]。

值得一提的是，一些特定類型的癌癥更容易受到特定銅依賴過程的影響，例如，限制體內的Cu的水平可以抑制乳腺癌的發展。前文所提到的TM可以將患者血液中的Cu減少一半，且幾乎沒有嚴重的副作用。TM治療降低了血液中骨髓來源的血管生成促進細胞的數量，可能是因為Cu需要激活對這些細胞重要的生長因子。TM對防止腫瘤轉移有效，這一作用防止癌癥復發作用明顯。三陰性乳腺癌是一種惡性程度高且容易復發的乳腺癌，通常會在一年內復發，隨后導致較高的短期死亡率。TM治療可明顯提高患者的生存率，有患者在TM治療8年后沒有出現癌癥復發的跡象[23]。

4.4 銅與免疫

近期發現，在患各種感染性疾病時，血清銅升高，刺激并增加肝臟合成和釋放銅藍蛋白，用來抵抗微生物的侵襲，而血清銅升高主要與中性粒細胞及巨噬細胞被激活時分泌的一種白細胞內源性物質有關，該物質隨血流到遠端靶組織發揮重要的免疫調節及殺菌功能。

實驗通過給小鼠喂養不同含銅量的飲食，發現低含銅量飲食組的小鼠的器官顯示出缺銅的特征性病變時，血清銅、銅藍蛋白水平降低且免疫反應低下，嚴重的銅缺乏將損害實驗動物的先天和獲得性免疫功能。分別用富銅和乏銅飲食喂養小鼠，分離脾淋巴細胞且用單克隆抗體標記后，用流式細胞計分離單個核細胞和決定表型輪廓，結果乏銅鼠的單個核細胞總數，T細胞的絕對數均減少，脾單個核細胞對致有絲分裂抗原的反應率下降，且這種對免疫功能的損害在雄性動物中比雌性動物更加明顯[24]。因此維持銅穩態平衡對于機體的健康非常重要。最近有報道通過補充生理劑量銅及其他營養素以改善老年人的免疫反應，取得了有效的結果，且降低感染性疾病的發生率，顯示合理補充微量元素可能為免疫功能的恢復提供幫助。

5 結語

銅作為一種重要的微量元素，在人體中發揮著極其重要的作用。銅的內穩態平衡對維持生命體的正常功能非常重要，因此，其攝取與外排過程都受到了嚴格的調控。銅的穩態被破壞可能導致多種生理功能的改變以及疾病的發生。然而，這一作用也可能被利用進行疾病的治療，例如通過下調銅的水平抑制癌癥的增殖。因此，未來有望可以針對銅相關的疾病，通過銅的配體和配合物的設計，恢復人體內正常的銅水平，實現治療作用；或針對腫瘤、炎癥等病癥，通過調控細胞內的銅水平，達到疾病治療的目的。