休哈特控制圖在總大腸菌群檢測中的應用

張澤清，弓躍華

(國家城市供水水質監測網太原監測站，山西太原 030008)

休哈特控制圖由美國休哈特(W.A.Shewhart)博士在20世紀20年代首先提出[1]，可用于發現實驗室在完成指定測試項目時是否存在異常波動，從而判斷檢測過程是否處于受控狀態，是實驗室常用的內部質量控制手段[2]，被國內外廣泛應用到制藥[3-4]、醫療[5-6]、食品[7]以及測繪[8]等方面。然而休哈特控制圖在我國實驗室水中微生物檢測方面的應用報道還比較鮮見。

二次供水作為我國城市供水的重要組成部分，由于可能存在水在水箱中長時間滯留等問題，時常發生微生物數量超標等水質被二次污染的情況[9]。在我國水質監測的幾種常見指示微生物中，總大腸菌群可用于評價輸配水系統的清潔度、完整性以及生物膜是否存在[10]，是用來判斷二次供水是否符合國家標準的重要指標。

本次試驗采用美國NSI公司的單一菌定量質控產品作為標準物質，對濾膜法和酶底物法[11]檢測總大腸菌群的過程進行了監測，將獲取的數據繪制成休哈特控制圖，通過控制圖判定檢測過程是否受控。后選取太原市60個二次供水實際樣品，使用受控的檢測體系，進行濾膜法和酶底物法的比對，并對陽性結果進行菌種鑒定。本試驗為了解太原市供水體系中二次供水總大腸菌群的基礎信息提供了一定的依據。

1 試驗材料與方法

1.1 主要試驗材料及設備

質控產品：采用美國NSI公司單一定量的總大腸菌群[菌株：NCTC 9001，ATCC：11775，平均值：1 429 MPN/(100 mL) (標準差SD=241)或1 487 CFU/(100 mL)(標準差SD=274)，可接受值：292～7 088 MPN/(100 mL)或506～3 613 CFU/(100 mL)。

培養基：廣東環凱品紅亞硫酸鈉培養基、廣東環凱乳糖蛋白胨培養液、美國愛德士(IDEXX)科立得。

生化培養箱：德國Memmert有限公司，IF260plus。

程控定量封口機：美國IDEXX生物科技有限公司，Quanti-TrayTMSealar PLUS。

溫控系統：上海安凈生物技術有限公司微生物實驗監控系統。

1.2 試驗方法

1.2.1 休哈特控制圖的繪制[12]

(1)濾膜法檢測總大腸菌群休哈特控制圖的繪制

按照《生活飲用水標準檢測方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)，使用濾膜法檢測美國NSI公司單一菌定量質控產品中的總大腸菌群。

取質控產品的真值[1 487 CFU/(100 mL)]為中位線，計算其警告限值上限為1 487+274×2=2 035 CFU/(100 mL)，警告限值下限為1 487-274×2=939 CFU/(100 mL)，行動限值上限為1 487+274×3=2 309 CFU/(100 mL)，行動限值下限為1 487-274×3=665 CFU/(100 mL)。將持續12周使用濾膜法檢測的總大腸菌群數據連成響應曲線，繪制成休哈特控制圖。

(2)酶底物法檢測總大腸菌群休哈特控制圖的繪制

按照《生活飲用水標準檢測方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)，使用酶底物法檢測美國NSI公司單一菌定量質控產品中的總大腸菌群。

取質控產品的真值[1 429 MPN/(100 mL)]為中位線，計算其警告限值上限為1 429+241×2=1 911 MPN/(100 mL)，警告限值下限為1 429-241×2=947 MPN/(100 mL)，行動限值上限為1 429+241×3=2 152 MPN/(100 mL)，行動限值下限為1 429-241×3=706 MPN/(100 mL)。將持續12周使用酶底物法檢測的總大腸菌群數據連成響應曲線，繪制成休哈特控制圖。

1.2.2 休哈特控制圖異常情況判定[12]

通過觀察休哈特控制圖的測量點，若存在如下一項或多項異常，應進行記錄調查和相應的補救措施。

(1)一項計數超出行動限值。

(2)同一側或不同側的3個連續計數中有兩個超過警告限值。

(3)9個連續的計數落在平均值的同一側。

(4)6個連續計數顯示持續上升或下降的趨勢。

1.2.3 二次供水中總大腸菌群的測定

分別采用濾膜法和酶底物法，對太原市送檢的60個二次供水實際樣品中的總大腸菌群進行檢測。每周抽檢5個，持續12周。

1.2.4 數據分析

將數據錄入SPSS Statistics軟件進行統計處理，進行配對樣本t檢驗。

1.2.5 菌種鑒定

若二次供水實際樣品中檢出總大腸菌群，則將長有菌落的平皿和帶有黃色孔穴的51孔定量盤均提交至愛德士緬因生物制品貿易(上海)有限公司，進行基因的提取和PCR擴增純化。然后提交至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI 中進行核酸序列BLAST，在序列數據庫中進行序列比對分析。

2 結果與討論

2.1 濾膜法檢測總大腸菌群休哈特控制圖

采用濾膜法對美國NSI公司的單一菌定量質控產品進行檢測，根據檢測的結果繪制休哈特控制圖(本次試驗的準確度為-2.6%，精密度為7.8%)，如圖1所示。根據休哈特控制圖的異常情況判定標準，持續12周的檢測數據無任何一項計數超出行動限值。僅第5周總大腸菌群質控產品的測量值為920 CFU/(100 mL)，超出警告限值下限，未發生同一側或不同側的3個連續計數中有兩個超過警告限值，也未發生9個連續的計數落在平均值的同一側，以及6個連續計數顯示有持續上升或下降趨勢的異常波動。因此，判定檢測過程受控。

圖1 濾膜法檢測總大腸菌群休哈特控制圖Fig.1 Shewhart Control Chart of Total Coliforms by Membrane Filter Technique

2.2 酶底物法檢測總大腸菌群休哈特控制圖

采用酶底物法對美國NSI公司的單一菌定量質控產品進行檢測，根據檢測的結果繪制休哈特控制圖(本次試驗的準確度為-0.4%，精密度為6.7%)，如圖2所示。根據休哈特控制圖的異常情況判定標準，持續12周的檢測數據無任何一項計數超出行動限值。僅第5周總大腸菌群質控產品的測量值為2 005 MPN/(100 mL)，超出警告限值上限，未發生同一側或不同側的3個連續計數中有兩個超過警告限值，也未發生9個連續的計數落在平均值的同一側，以及6個連續計數顯示有持續上升或下降趨勢的異常波動。因此，判定檢測過程受控。

圖2 酶底物法檢測總大腸菌群休哈特控制圖Fig.2 Shewhart Control Chart of Total Coliforms by Enzyme Substrate Technique

2.3 休哈特控制圖的應用、優勢和展望

由圖1和圖2可知，雖然可以判定濾膜法和酶底物法檢測總大腸菌群的過程受控，但是兩種方法檢測的數據在第5周均超出了警告限值。經回溯，主要在于定量質控溶解時間雖然符合使用說明，但是相較于其他幾周，使用濾膜法時，溶解時間相對較短，導致結果偏低；使用酶底物法時，溶解時間相對較長，導致結果偏高。由此可知，第5周數據的波動并非是系統因素導致，檢測過程可以正常運行。

本試驗中，第5周濾膜法的測量值為920 CFU/(100 mL)，在可接受值[506～3 613 CFU/(100 mL)]；酶底物法的測量值為2 005 MPN/(100 mL)，在可接受值[292～7 088 MPN/(100 mL)]。由于常規的質控方法通常根據標準規定的時間和批次實施，并不會連續進行，若操作符合要求，微生物在水中分布不均勻[13]，單次數據對真值的偏離通常不會觸發進一步的調查和補救行動。與此相對，休哈特控制圖則以直觀的方式提供了一種持續性改進的工具，在提高試驗精確度方面起到了一定的作用。

此次試驗僅以總大腸菌群作為研究對象，鑒于耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌是總大腸菌群的組成部分，推測休哈特控制圖也可以在水中耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測過程中加以運用。

2.4 二次供水總大腸菌群檢測結果對比

60個二次供水實際樣品分別采用濾膜法和酶底物法進行測定，兩種檢測方法均測得2個陽性樣品，分別為59號和60號，其試驗結果如表1所示。這60個二次供水水樣的總大腸菌群陽性率約為3.3%。

將數據錄入SPSS Statistics軟件進行配對樣本t檢驗，結果表明，對于二次供水總大腸菌群的檢測而言，濾膜法和酶底物法在統計學上無顯著性差異(P>0.05)。

表1 60個二次供水實際樣品濾膜法和酶底物法結果對比Tab.1 Comparison of Results of Membrane Filter Technique and Enzyme Substrate Technique for 60 Samples in Secondary Water Supply System

圖3(a)和圖3(b)分別為59號和60號樣品經抽濾并培養后的生長狀況，在品紅亞硫酸鈉培養基平皿上生長為圓形、邊緣整齊、深紅色、不帶金屬光澤的菌落，菌落數分別為1.0 CFU/(100 mL)和29.0 CFU/(100 mL)。經革蘭氏染色為陰性無芽孢桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養液，培養后產酸產氣，判定為總大腸菌群陽性。

圖3 水樣在品紅亞硫酸鈉培養基上的生長狀況Fig.3 Growth Conditions of Water Samples on Fuchsia Sodium Sulfite Medium

圖4(a)和圖4(b)分別為59號和60號樣品在51孔定量盤上的生長狀況。59號在51孔定量盤上顯示黃色反應的孔穴數分別為18個，60號為12個，對應的總大腸菌群最可能數分別為22.2 MPN/(100 mL)和13.7 MPN/(100 mL)。

圖4 水樣在51孔定量盤上的生長狀況Fig.4 Growth Conditions of Water Samples on 51-Well Quantitative Disc

研究表明，2007年山西省二次供水的合格率為97.1%[13]，太原市此次抽檢的二次供水水樣總大腸菌群陽性率為3.3%，因未涉及其他指標，此次水樣存在著未達到96.7%合格率的可能，需要引起足夠的重視。此外，此次抽檢的時間為春季—夏季，兩個連續檢出總大腸菌群的水樣均發生在夏季，推測總大腸菌群陽性率可能與季節存在一定的相關性[14]。

總大腸菌群的酶底物法比濾膜法要靈敏，故檢出的總大腸菌群一般比濾膜法要高[15]。60號的濾膜法比酶底物法檢出了更多的總大腸菌群，可能是微生物在水中的分布不均勻所致[16]。

2.5 菌種鑒定

使用分子生物學的方法，經初步鑒定，59號和60號水樣分別在濾膜和51孔定量盤上均鑒定出相同的菌種，兩種檢測方法所得結果一致。59號水樣中所含的總大腸菌群為腸桿菌科克雷伯菌屬的新加坡克雷伯氏菌(Klebsiellasingaporensis)，60號水樣中所含的總大腸菌群為腸桿菌科勒克菌屬的非脫羧勒克菌(Leclerciaadecarboxylata)，無假陽性。

新加坡克雷伯氏菌最先于新加坡被分離出來，屬于克雷伯氏菌屬的一種[17]。克雷伯氏菌屬可寄生于人和動物的呼吸道或腸道，為條件致病菌，可引起肺炎、軟組織感染甚至敗血癥等疾病[18]。

非脫羧勒克菌是勒克菌屬唯一的菌種，是一種罕見的腸桿菌科細菌。在一定條件下可對人體具有致病力，是條件致病菌，與人類腹瀉密切相關，曾在腹瀉患者糞便和痰液中有檢出[19]。

這些病原菌的檢出比較明確地提示了二次供水被污染的風險。根據我國部分地區的調查顯示，影響二次供水水質的主要因素有供水來源水廠等級、水箱是否定期清洗消毒、水箱管材的質量和管理水平。不合格的主要項目包含了微生物指標[9,20]。太原市供水多為深層地下水，水質優良，因此，這些病原菌的檢出也為改善二次供水的質量指明了方向。

3 結論

(1)休哈特控制圖實現了對濾膜法和酶底物法檢測總大腸菌群過程的有效監測。相較于常規質控方法，休哈特控制圖提供了一種持續改進的工具，其成功實施也為應用于水中其他微生物的檢測過程提供了可能性。

(2)太原市60個二次供水實際樣品的總大腸菌群陽性率為3.3%，存在著與季節相關的可能性。

(3)兩個陽性結果經初步鑒定，分別為腸桿菌科克雷伯菌屬的新加坡克雷伯氏菌(Klebsiellasingaporensis)和勒克菌屬的非脫羧勒克菌(Leclerciaadecarboxylata)，無假陽性。