生活飲用水中細菌總數檢測的方法比較與應用

鄭亦舟

(上海浦東威立雅自來水有限公司，上海 200127)

近年來，隨著人們生活品質的不斷提高，對高品質飲用水的需求也愈加迫切，而飲用水中生物安全性指標是保證飲用水品質的重要一環。2018年1月4日，上海市政府發布的《上海市城市總體規劃(2017—2035年)》提出“提高入戶水質，滿足直飲需求”。相應供給端的檢測市場對于生活飲用水中微生物指標檢測方法的研究也隨著需求提升不斷開展，各種產品化的檢測試劑盒也是層出不窮。其中，供水企業常用的水中細菌總數檢測方法有異養菌平板計數法(heterotrophic plate count，HPC)、酶底物法以及ATP生物熒光檢測法。《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2006)中生活飲用水的菌落總數限值規定為<100 CFU/mL。通過樣品在營養瓊脂上有氧條件培養，對所得水樣中含菌落的數量進行計數，以反映水中微生物的生長情況。由于培養溫度高、培養時間相對短，營養瓊脂HPC方法具有一定局限性，很多報道中會用R2A HPC檢測異養菌數量來代替營養瓊脂HPC檢測樣品中的微生物水平，通過一種低營養含量的培養基(R2A培養基)，配合較低的培養溫度和延長的培養時間，以獲得更加適用于生活飲用水中微生物實際水平的檢測結果[1-3]。

酶底物法(defined substrate technology，DST)在生活飲用水的檢測中多被研究應用于總大腸菌群和嗜肺軍團菌的檢測，其靈敏度更高、操作流程簡單，具有很好的應用前景[4-5]。該方法通過選擇性培養基來對產生某種酶的細菌群組進行檢測。但在細菌總數的檢測中應用較少，理論上它可以通過選擇性培養基分解色原底物從而釋放色原體，使培養基呈現顏色變化，通過計數變色的孔徑數量來檢測水中的細菌總數。因此，酶底物法在生活飲用水細菌總數檢測中的應用及其與培養法的對比是值得研究的課題。

三磷酸腺苷(ATP)生物發光法檢測：ATP是細菌、藻類、植物和動物細胞等所有生命形式的主要能量載體，測量樣品中ATP的濃度可以獲得微生物濃度和其健康狀況的關鍵數據。20世紀70年代中期該技術逐漸形成并產生，ATP可以存在于活性微生物細胞內(cATP，胞內ATP)和游離在細胞以外(dATP、胞外ATP)，通過使用照度計來測量ATP和螢光素酶催化反應的發光強度(RLU)來進行樣品中ATP濃度的定量分析。目前，已有研究表明微生物濃度和ATP含量之間存在相互關系，可以通過ATP濃度的測定來反映細菌濃度的實際情況[6]。將ATP生物熒光法用于生活飲用水中細菌總數的檢測須通過膜過濾富集，同時適當添加緩沖劑、熒光劑等[7]，其應用場景和檢測過程的便捷性是檢測市場十分關注的問題。

本文從水質檢測實驗室細菌總數檢測方法應用的角度，通過4種生活飲用水細菌總數檢測方法分別對標準物質樣品、水源水樣品及出廠水樣品進行對比檢測，以探究各檢測方法所適用的檢測場景，以期對高品質飲用水的保障手段進行探討。

1 材料與方法

采集上海浦東某水廠出廠水樣品和水源水樣品，采購IDEXX菌落總數質控樣品(產品編號：HPCQC，批號：200820)，采用營養瓊脂培養基(PCA)、R2A培養基、ATP試劑盒以及IDEXX SimPlate復合酶底物來對樣品進行檢測。

使用121 ℃下滅菌20 min的玻璃細菌瓶，預先加入少量摩爾濃度為0.001 mol/L的Na2S2O3中和出廠水中的余氯。秉持無菌操作的原則對采樣龍頭進行消毒后，采集水源水樣和出廠水樣。質控樣品按照標準樣品說明書制備。

1.1 培養基的成分

PCA：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂10～20 g、蒸餾水1 000 mL。pH值控制在7.4～7.6，在103.43 kPa(121 ℃，20 min)下滅菌后，分裝待用。

R2A培養基：酵母浸出粉0.5 g、蛋白胨0.5 g、酪蛋白水解物0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、磷酸氫二鉀0.3 g、無水硫酸鎂0.024 g、丙酮酸鈉0.3 g、瓊脂15.0 g。pH值控制在7.4～7.6，在103.43 kPa(121 ℃，20 min)下滅菌后，分裝待用。

1.2 檢測方法的選擇

菌落總數的檢測：按照《生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)1.1節平皿計數法的檢驗步驟，將水樣在營養瓊脂上有氧條件37 ℃培養48 h后，測量所得1 mL水樣所含菌落的總數。

異養菌計數法的檢測：分別用平板傾注法和平板涂布法將水樣在R2A培養基上有氧條件(25 ℃)培養7 d后，測量所得1 mL水樣所含異養菌菌落的總數。

酶底物法的檢測：將水樣加入SimPlate培養基，混勻后加入SimPlate定量盤使之裝滿所有的孔槽；倒置培養定量盤在(36±1) ℃培養48 h；于紫外燈下讀取熒光的孔格，對照MPN表讀取檢測結果。

ATP生物熒光法的檢測：將50 mL水樣經過富集后的過濾器萃取液放入測試管，加入試劑盒配套的熒光素酶試劑，再加入稀釋液后旋轉搖勻并在10 s內讀數；該結果減去空白值后記為樣品中ATP發光強度，從而用于ATP的定量分析。

2 結果與討論

2.1 微生物培養法對不同來源樣品的檢測結果

基于菌落培養原理對生活飲用水中的生物穩定性進行評價的3種方法分別是營養瓊脂HPC檢測方法、R2A HPC傾注檢測方法、R2A HPC涂布檢測方法。表1羅列了應用這3種培養方法對同一標準物質樣品、水源水樣品及出廠水樣品檢測的結果。其中，出廠水樣品為生活飲用水檢測實驗室中常見的低濃度樣品，標準物質樣品的細菌總數控制在102CFU/mL數量級代表中等濃度樣品，水源水樣品為生活飲用水檢測實驗室中常見的高濃度樣品。首先，對于已知濃度的標準質控樣品，3種方法的檢測結果都在其真值的2倍標準偏差可接受范圍內，都能較好地反映水樣中異養菌含量。其次，3種檢測方法對中低高這3個濃度梯度樣品的檢測結果呈現一致性的大小排序，HPC涂布法檢測結果略高于HPC傾注法檢測結果，HPC傾注法檢測結果略高于平皿計數法，但基本在同一數量級上。造成該結果的原因可能是HPC傾注法與HPC涂布法取樣量的差異，傾注法的取樣量是涂布法的10倍，因此，檢測結果為乘以差異的倍數來計數最終的報告結果，其中無法排除取樣量的不同而造成的結果影響。另外，溫度在45 ℃左右的培養基在傾注的過程中會將某些好氧菌滅活或者會被覆蓋在培養基的中間區域，在培養過程中無法生長為菌落參與結果計數，造成結果偏低。

表1 培養法檢測各樣品結果Tab.1 Results of Each Sample Tested by Culture Method

平皿計數法與HPC計數法相比，培養基、培養時間和培養溫度均不同。HPC計數法通過低營養含量配合更長的培養時間和較低的溫度，使其生長的環境更接近生活飲用水，從而能夠對飲用水中的一些受抑制的耐氯菌、假單胞菌等有更好的檢出限和靈敏性[8]。因此，平皿計數法在較高溫度和較短時間條件下，培養產生的菌落數低于HPC計數法貧營養培養基在低溫和長時間下培養的菌落數。對于生活飲用水樣品而言，菌落數較少，HPC計數法具有更高的靈敏度，更能反映水樣中真實的生物穩定性變化。

綜合3種培養方法的檢測結果，R2A HPC涂布法在25 ℃下，培養7 d，所得的1 mL樣品所含的菌落總數結果具有更高的靈敏性，能夠更真實地反映水樣中的微生物生長情況。

2.2 酶底物法對不同來源樣品的檢測結果

實際應用酶底物法檢測生活飲用水中細菌總數的最大難點，在于其檢測原理與結果計數方法和培養法完全不同而導致最后結果的表示方式不同，酶底物法的計數結果以統計學概念中最大可能數(MPN/mL)來表示，而培養法的計數結果以菌落形成數(CFU/mL)來表示。基于檢測原理的限制，兩類方法的檢測結果不能完全等同比較。對不同來源樣品的檢測結果如表2所示，對于已知濃度的標準質控樣品，酶底物法的檢測結果能夠落在其真值的3倍標準偏差可接受范圍內，能夠定量地反映水樣中異養菌數量。對于水源水和出廠水樣品，雖然計數結果表示方式不同，但其檢測結果都能夠和培養法在同一數量級上，最大可能數的取值整體會高于菌落生成數的數量。在實際檢測市場中，由于生活飲用水國家標準的微生物指標限值由CFU/mL來計數，在一定程度上限制了酶底物法在部分市場中的應用。不過該方法有其顯著的優勢和適用場景，將會在下文進一步討論。

表2 酶底物法檢測各樣品結果Tab.2 Result of Each Sample Detected by Enzyme Substrate Method

2.3 ATP檢測法對不同來源樣品的檢測結果

應用ATP生物熒光法對不同來源樣品的檢測結果如表3所示，該方法通過使用照度計來測量ATP和螢光素酶催化反應產生的RLU，因此，所得的定量值為熒光發光的強度，間接定量計算出生活飲用水中每毫升樣品ATP的含量。而本文中第二代ATP檢測方法在檢測生活飲用水時的富集和過濾階段將<0.45 μm的游離ATP或溶解ATP去除在過濾器之外，因此，由過濾器萃取液中檢測所得的ATP含量是cATP，更能反映生活飲用水內的微生物含量。此法的檢測結果表示與酶底物法有同樣的應用難點問題，由于檢測原理的限制所得結果與培養法和酶底物法所得的檢測結果只能在趨勢性和相關性上找到一些聯系，從而進行快速的判斷與分析。以文中生活飲用水樣品中標準物質樣品的檢測結果來看，ATP生物熒光檢測法與營養瓊脂HPC檢測法之間的關系式為y=12.30x2-130.11x+247.58，相關性判定系數R2為0.821 8，具有一定的相關性。ATP生物熒光檢測法與培養法之間的結果相關性研究也是國內外細菌總數檢測應用研究的熱點[9]。國內生活飲用水檢測的多數標準和限值是以菌落總數平皿計數法的結果作為基準來衡量生活飲用水的生物安全性，但是該方法存在明顯的滯后性，對于生活飲用水這樣無時無刻在被使用及流動的物質而言，ATP生物熒光法此類有著較短檢測時間和簡易操作過程的檢測方法也有一定的市場需求，有其得天獨厚的檢測優勢。

表3 ATP生物熒光法檢測各樣品結果Tab.3 ATP Method Test Results of Each Sample

2.4 各檢測方法檢測過程比較與適用場景討論

各檢測方法檢測過程的比較結果如表4所示。在方法依據上營養瓊脂HPC檢測法是國內主流的檢測生活飲用水中微生物指標的方法，其他的3種檢測方法的使用范圍有限，數據量積累不多，但都有其比較明顯的優勢。酶底物法與ATP生物熒光法在人員要求和環境要求上只需簡單的培訓后在現場或戶外場地即可進行試驗操作，省去了人員培訓的周期和場地的限制，大大增加了細菌總數檢測的機動性和應急性。除此之外，ATP生物熒光法的檢測時間可以控制在5 min之內出具結果，檢測儀器較小、攜帶方便。但是其檢測成本耗材價格較高，單次檢測成本為培養法的數十倍，且無法將ATP的來源加以區分，也不能識別微生物的種類。有時樣品或ATP提取劑等來源的某些離子會對ATP的測定造成干擾和抑制發光作用，其靈敏度仍不能滿足某些樣品的直接檢測要求。因此，在檢測低濃度微生物時，檢測結果不夠準確[9]，產生假陽性的可能性較大[10]，需結合其他技術輔助檢測進一步驗證。而對于濃度較高的樣品，例如水源水樣品，其檢測結果中ATP含量可能有一部分是源于其他微生物甚至是動物或植物細胞，這時造成檢測結果偏高的值是不可忽略不計的，這也是ATP檢測結果會與實際樣品中存在的細菌真值出現較大誤差的重要原因之一。目前水質應急事件保障過程中，可行的方案是同步采集水樣，采用菌落總數平皿計數法和ATP生物熒光法檢測，先根據ATP生物熒光法檢測結果進行一些時效性高的應急處理措施。隨后水樣的微生物指標達標與否需參考菌落總數平皿計數法的結果與國家標準進行符合性判定。而酶底物法可能應用的場景是移動實驗室等無法很好地保證環境無菌的情況下對生活飲用水中微生物含量的檢測，能夠盡可能避免環境污染，保證檢測結果的有效性。

表4 各檢測方法檢測過程比較Tab.4 Comparison of the Detecting Process of Each Detection Method

3 結論

通過應用不同檢測方法分別對標準物質樣品和上海浦東某水廠樣品進行微生物指標的檢測，ATP生物熒光檢測方法檢測效率最高，平均單個樣品檢測時間為5 min，且操作簡單，適用于水質應急事件等時效性要求較高的突發事件的現場處理。在實際市場應用時，根據不同水質檢測需求可配套使用多種其他檢測方法。培養法中R2A HPC涂布檢測方法對生活飲用水中微生物指標的檢測靈敏性更高，但檢測周期較長、人員和環境要求嚴格，在實際市場應用時需根據檢測需求配套使用其他檢測方法。酶底物法可用于移動實驗室等無法很好地保證環境無菌情況下的細菌總數檢測。