基于系統(tǒng)藥理學(xué)探討莪術(shù)醇調(diào)控鐵死亡和細(xì)胞自噬的作用機(jī)制

王佳慧，何文星，黃茹君，何佳禧，黎小清，鄭 洋，汪 磊

莪術(shù)是姜科植物蓬莪術(shù)(CurcumaphaeocaulisVal)，廣西莪術(shù)(C.kwangsiensisS.G.Leeet.C.F.Liang)的干燥根莖，具有行氣破血、消積止痛之功，對脅痛等有效果[1]。莪術(shù)醇是莪術(shù)的主要活性成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗炎等作用[2]。目前對莪術(shù)醇的研究主要集中在癌癥以及慢性肝病領(lǐng)域。鐵超載和脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是鐵死亡的中心環(huán)節(jié)[3]。有研究[4]表明，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，可以有效阻止肝纖維化的發(fā)展。細(xì)胞自噬是通過溶酶體降解自身組分以維持穩(wěn)態(tài)的過程。細(xì)胞自噬對肝纖維化的調(diào)控是雙向的[5]。細(xì)胞自噬通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的脂質(zhì)代謝促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展；另一方面，細(xì)胞自噬通過調(diào)控肝細(xì)胞在肝臟炎癥和肝臟代謝穩(wěn)態(tài)等細(xì)胞功能抑制肝纖維化的發(fā)展[6]。鐵死亡和細(xì)胞自噬在肝纖維化的發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用，為了探究莪術(shù)醇和鐵死亡與細(xì)胞自噬之間的關(guān)系。該研究使用系統(tǒng)藥理學(xué)的方法對莪術(shù)醇調(diào)控鐵死亡和細(xì)胞自噬的分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 莪術(shù)醇化學(xué)成分靶點預(yù)測本研究使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)(http:ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)收集莪術(shù)醇藥效成分信息，保存為mol2格式文件，然后將其上傳PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)。基于反向藥效團(tuán)匹配法，選擇藥物的藥效團(tuán)模型, 設(shè)置最終產(chǎn)生300個蛋白構(gòu)象，得到與化合物相關(guān)的靶點名稱、基因名稱、Uniprot ID等結(jié)果。借助Uniprot(https://www.uniprot.org/)，對化合物預(yù)測產(chǎn)生的靶點進(jìn)行篩檢，只保留物種為“Homo sapiens”的靶點。

1.2 鐵死亡和細(xì)胞自噬相關(guān)靶點的獲取鐵死亡相關(guān)靶點是在FerrDb數(shù)據(jù)庫(http://www.zhounan.org/ferrdb)中獲取的，細(xì)胞自噬相關(guān)靶點在HAMdb(http://hamdb.scbdd.com/)數(shù)據(jù)庫中檢索獲取，從而構(gòu)建相應(yīng)數(shù)據(jù)庫。

1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建采用Venny2.1對莪術(shù)醇作用靶點與鐵死亡相關(guān)靶點；以及與細(xì)胞自噬相關(guān)靶點進(jìn)行交互處理，同時采用Venny2.1對三者共同靶點進(jìn)行交互處理，而后借助蛋白互作String數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)靶點互作信息，使用Cytoscape3.6.0將互作靶點進(jìn)行可視化處理。

1.4 生物信息學(xué)分析使用基因本體論(GO)注釋數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.geneontology.org)，京都基因與基因組百科全書(KEGG)路徑富集分析(http://www.genome.jp/kegg/)對這些靶點進(jìn)行可視化和生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇作用靶點以及鐵死亡和細(xì)胞自噬相關(guān)靶點的確定使用Pubchem數(shù)據(jù)庫確認(rèn)了莪術(shù)醇的結(jié)構(gòu)，通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲得了莪術(shù)醇的作用靶點300個，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫，對化合物預(yù)測產(chǎn)生的靶點進(jìn)行篩檢與檢查，剔除重復(fù)、非人源與不規(guī)范的靶點，最終只得到了152個靶點。在FerrDb數(shù)據(jù)庫中選取抑制和促進(jìn)鐵死亡以及其標(biāo)志物，去除三者重復(fù)的靶點，最終獲得與鐵死亡關(guān)系密切的靶點259個，在HAMdb數(shù)據(jù)庫中獲取了與細(xì)胞自噬關(guān)系密切的靶點796個。

2.2 關(guān)鍵靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析對莪術(shù)醇作用靶點和鐵死亡靶點進(jìn)行交互處理，得到14個共同靶點，分別是MAPK8、AKR1C2、ALB、MAPK1、MAPK14、DPP4、NOS2、AKR1C3、AKR1C1、PTGS2、SRC、HNF4A、NQO1、ALOX15；莪術(shù)醇與細(xì)胞自噬靶點交互處理得到21個靶點，分別是MAPK8、MAPK10、KDR、ALB、MAPK14、IGF1R、FKBP1A、MAPK1、HSP90AA1、PPARG、CTSB、CHEK1、PKM、NOS3、IRGM、PDPK1、GSK3B、NQO1、PRKCD、CAMKK2、NOS2；莪術(shù)醇與細(xì)胞自噬和鐵死亡共同重復(fù)靶點6個，分別是MAPK8、ALB、MAPK14、MAPK1、NOS2、NQO1，如圖1A所示。

莪術(shù)醇抗鐵死亡的14個靶點，借助String數(shù)據(jù)庫獲取其相互作用數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape3.6.0進(jìn)行可視化(如圖1B所示)，其中度值排名前5的分別是PTGS2、ALB、MAPK1、MAPK8、MAPK14，說明這些靶點是關(guān)鍵靶點在這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用，圖中節(jié)點的大小反映了度值的大小。

莪術(shù)醇抗細(xì)胞自噬的21個靶點，借助String數(shù)據(jù)庫獲取其相互作用數(shù)據(jù)，只獲得了19個靶點相互作用的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape3.6.0進(jìn)行可視化(如圖1C所示)，其中度值排名前5的分別是HSP90AA1、MAPK1、MAPK8、ALB、NOS3，說明這些靶點是關(guān)鍵靶點在這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用，圖中節(jié)點的大小反映了度值的大小。

莪術(shù)醇與鐵死亡和細(xì)胞自噬重復(fù)靶點6個，借助String數(shù)據(jù)庫獲取其相互作用數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape3.6.0進(jìn)行可視化(如圖1D所示)，其中度值排名前3的分別是MAPK1、MAPK8、ALB，說明這些靶點是莪術(shù)醇調(diào)控鐵死亡以及細(xì)胞自噬的關(guān)鍵靶點，也反映了鐵死亡和細(xì)胞自噬之間的關(guān)系密切，圖中節(jié)點的大小反映了度值的大小。

圖1 莪術(shù)醇調(diào)控鐵死亡和細(xì)胞自噬相關(guān)靶點A：莪術(shù)醇作用靶點與鐵死亡以及細(xì)胞自噬相關(guān)靶點交互；B：莪術(shù)醇調(diào)控鐵死亡靶點互作網(wǎng)絡(luò)；C：莪術(shù)醇調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)靶點互作網(wǎng)絡(luò)；D:莪術(shù)醇與鐵死亡和細(xì)胞自噬重復(fù)靶點互作網(wǎng)絡(luò)

2.3 關(guān)鍵靶點途徑和功能的富集分析從莪術(shù)醇作用的152個靶點中收集到14個調(diào)控鐵死亡的靶點，為了確定相關(guān)的途徑和功能，對這些可能的靶點按照P<0.01進(jìn)行了通路富集和GO功能分析。這些靶點的生物過程、分子功能以及細(xì)胞組分分別是對刺激的反應(yīng)、代謝過程、生物調(diào)節(jié)過程；細(xì)胞因子活力、抗氧化的能力、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活力；主要位于細(xì)胞器和細(xì)胞膜上，富集途徑主要包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路、花生四烯酸代謝通路、白細(xì)胞介素17(interleukin 17, IL-17)信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路等，具體見圖2。

從莪術(shù)醇作用的152個靶點中收集到21個調(diào)控細(xì)胞自噬的靶點，為了確定相關(guān)的途徑和功能，對這些可能的靶點按照P<0.01進(jìn)行了通路富集和GO功能分析。這些靶點的生物過程、分子功能以及細(xì)胞組分分別是細(xì)胞增殖、生長、免疫過程；結(jié)合、抗氧化的能力、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活力；主要位于細(xì)胞器和細(xì)胞外，富集途徑主要包括NOD樣受體信號通路、自噬通路、FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路等，具體見圖3。

圖3 莪術(shù)醇調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)靶點功能富集分析A：莪術(shù)醇調(diào)控細(xì)胞自噬靶點的GO分析；B：莪術(shù)醇調(diào)控細(xì)胞自噬靶點通路分析

從莪術(shù)醇作用的152個靶點中收集到了6個與細(xì)胞自噬和鐵死亡重復(fù)的靶點，為了確定相關(guān)的途徑和功能，筆者對這些可能的靶點按照P<0.01進(jìn)行了通路富集和GO功能分析。這些靶點的生物過程、分子功能以及細(xì)胞組分分別是生物過程的負(fù)調(diào)控、抗氧化的能力、主要位于細(xì)胞器，富集途徑主要包括ErbB信號通路、GnRH信號通路、HIF-1信號通路等，具體見圖4。

圖4 莪術(shù)醇與鐵死亡和細(xì)胞自噬重復(fù)靶點功能富集分析A：莪術(shù)醇與鐵死亡和細(xì)胞自噬重復(fù)靶點的GO分析；B：莪術(shù)醇與鐵死亡和細(xì)胞自噬重復(fù)靶點的通路分析

3 討論

鐵死亡是谷胱甘肽過氧化物酶4的含量下降，導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原平衡被打破，引起脂質(zhì)過氧化物積累，從而誘發(fā)細(xì)胞死亡的一種類型。細(xì)胞自噬主要由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹衰老或受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、病原微生物等形成自噬溶酶體，然后利用溶酶體中的各種水解酶降解所包裹的內(nèi)容物，為細(xì)胞提供物質(zhì)與能量來源，是細(xì)胞針對內(nèi)外環(huán)境變化的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[7]。近年來細(xì)胞自噬與鐵死亡之間的調(diào)控關(guān)系受到廣大科研工作者的關(guān)注，對兩者之間的關(guān)系目前主要有三種觀點：相互促進(jìn)，雙氫青蒿素通過促進(jìn)鐵蛋白自噬，增加ROS活性氧積累，誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞鐵死亡，同時抑制自噬可以抑制細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生[8]；相互獨立，有研究顯示西拉米辛和拉帕替尼聯(lián)用既可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，也可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，但兩種死亡方式發(fā)生順序不同，提示鐵死亡過程與自噬過程獨立發(fā)生作用[9]；相互拮抗，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞自噬活性可以誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生，并且增加了其對替莫唑胺的敏感性，提示自噬和鐵死亡之間存在拮抗關(guān)系[10]。

本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)的研究方法，對莪術(shù)醇調(diào)控兩種生理過程的可能機(jī)制進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，莪術(shù)醇可以通過PTGS2、ALB、MAPK1、MAPK8、MAPK14等靶點發(fā)揮調(diào)控鐵死亡的作用，這些靶點的功能主要集中在調(diào)控細(xì)胞增殖、抗氧化活性、轉(zhuǎn)錄活性，靶點的途徑主要集中在VEGF信號通路、TNF信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路，這些結(jié)果表明莪術(shù)醇很有可能是調(diào)控炎癥反應(yīng)以及血管新生等過程影響鐵死亡的發(fā)生發(fā)展。莪術(shù)醇可以通過HSP90AA1、MAPK1、MAPK8、ALB、NOS3等靶點發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞自噬的作用，這些靶點的功能主要集中在調(diào)控細(xì)胞增殖、抗氧化活性、轉(zhuǎn)錄活性，靶點的途徑主要集中NOD樣受體信號通路、FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路，PI3K-Akt以及FoxO信號通路都是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、生長的上游信號[11]。莪術(shù)醇可以通過ALB、MAPK1、MAPK8等靶點發(fā)揮調(diào)控鐵死亡和細(xì)胞自噬的作用，這些靶點的功能主要集中在調(diào)控細(xì)胞增殖、抗氧化活性，靶點的途徑主要集中在HIF-1信號通路，莪術(shù)醇調(diào)控鐵死亡和細(xì)胞自噬與HIF-1、VEGF信號通路以及HSP90AA1、NOS3等靶點關(guān)系密切，而這些靶點和通路與血管新生關(guān)系密切。說明鐵死亡和細(xì)胞自噬是可以調(diào)控血管新生的過程，本研究將為莪術(shù)醇在慢性肝病的研究領(lǐng)域開拓新的視角，進(jìn)一步推動廣西道地藥材莪術(shù)的開發(fā)與利用。鐵死亡和細(xì)胞自噬之間關(guān)系密切，但是具體的調(diào)控機(jī)制需要基礎(chǔ)實驗進(jìn)一步驗證。

綜上，本研究顯示莪術(shù)醇通過PTGS2、ALB、MAPK1等靶點發(fā)揮調(diào)控鐵死亡的作用，也可以通過HSP90AA1、MAPK1、MAPK8等靶點發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞自噬的作用，表明莪術(shù)醇可能通過調(diào)控鐵死亡和細(xì)胞自噬發(fā)揮藥理作用。