組蛋白去甲基化酶KDM2A在支氣管哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑中的作用

王志霞，羅 湘，王利江，劉 燕，郭 春，楊 洋，張志強(qiáng)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是不可逆性氣流受限，具有多種表型的異質(zhì)性疾病[1]。氣道重塑與慢性氣道炎癥是支氣管哮喘的病理特征，哮喘是受環(huán)境影響的多基因遺傳疾病，基因與環(huán)境的相互作用研究有助于了解哮喘的發(fā)病機(jī)制。表觀遺傳是在不改變DNA序列基礎(chǔ)上的基因表達(dá)的遺傳變化，是聯(lián)系環(huán)境與基因的紐帶，它可以彌補(bǔ)遺傳背景和環(huán)境危險(xiǎn)因素之間的差距，是研究哮喘發(fā)病機(jī)制的重要領(lǐng)域[2]。組蛋白去甲基化酶KDM2A是調(diào)節(jié)組蛋白甲基化重要的一個(gè)蛋白，在細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤及人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)等方面有重要作用[3]。目前KDM2A在支氣管哮喘中的研究較少，其是否參與哮喘氣道炎癥及氣道重塑過程尚不清楚。為更好地了解KDM2A在支氣管哮喘中的作用機(jī)制，通過觀察哮喘大鼠肺組織KDM2A蛋白表達(dá)的變化，探討KDM2A對(duì)氣道炎癥及氣道重塑的影響，以期為哮喘發(fā)病機(jī)制提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性SD大鼠18只，6～8周齡，200～250 g，所有動(dòng)物均在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物設(shè)施中飼養(yǎng)，大鼠飼養(yǎng)于12 h白天12 h黑夜定時(shí)周期循環(huán)的屏障系統(tǒng)中，屏障系統(tǒng)維持19～23 ℃的溫度和(55±10)%濕度，食物和水供應(yīng)充足。所有的實(shí)驗(yàn)過程都獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器氫氧化鋁凝膠、卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)購(gòu)自于北京索萊寶公司；蘇木精、伊紅染色劑、多聚甲醛由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科饋贈(zèng)；Masson染色試劑盒、PAS染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；α平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、賴氨酸特異性的去甲基化酶 2A(lysine-specific demethylase 2A，KDM2A)一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；β-actin、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購(gòu)自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；NE-C900型超聲霧化器購(gòu)自歐姆龍醫(yī)療設(shè)備有限公司；電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1應(yīng)用OVA致敏的方法建立支氣管哮喘大鼠模型 經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查同意后，選擇18只6～8周齡SPF級(jí)雌性大鼠，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組、哮喘4周組、哮喘8周組，采用OVA制作哮喘模型[4]，SD大鼠在第1天和第7天腹腔注射0.2 ml含有OVA 0.2 mg和氫氧化鋁凝膠0.4 mg的磷酸鹽緩沖液(PBS)；于第15天開始每天霧化吸入5%OVA 30 min激發(fā)哮喘，正常對(duì)照組霧化吸入PBS代替致敏原致敏。

1.3.2大鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)

1.3.2.1 HE染色 取大鼠左肺組織，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟(乙醇脫二甲苯分別為無水乙醇Ⅰ 10 min，無水乙醇Ⅱ 10 min，95%酒精 Ⅰ 10 min，95%酒精 Ⅱ 10 min，80%酒精5 min, 雙蒸水 1 min)，蘇木精染核2 min，1%鹽酸酒精分化1 s，流水返藍(lán)15 min，伊紅溶液浸泡30 s，流水沖洗后放入無水乙醇2 min，二甲苯5 min，中性樹脂封片。

1.3.2.2 PAS染色 將切片放入0.5%的高碘酸水溶液中氧化5 min，迅速用蒸餾水洗5 min后加入Schiff試劑染色30 min，接著用偏中亞硫酸鈉浸洗2次，用蒸餾水沖洗5 min，蘇木精染細(xì)胞核5 min，鹽酸酒精分化，充分水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2.3 Masson染色 脫蠟同HE染色，蘇木精染核2 min, 1%鹽酸酒精分化1 s，流水返藍(lán)15 min，麗春紅-酸性品紅溶液浸泡15 min，1%冰醋酸15 s，流水15s ，1%磷鉬酸磷鎢酸溶液浸泡15 min后立即置入苯胺藍(lán)中15 min，超純水和1%冰醋酸1 s，充分水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.3肺組織病理圖片分析

1.3.3.1 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn) 采用半定量評(píng)分(0～4)評(píng)價(jià)支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，在顯微鏡下選擇長(zhǎng)徑與短徑之比≥0.6的完整氣道，氣道炎癥評(píng)分：0分，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1分，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；2分，1層炎癥細(xì)胞圍繞氣道；3分，2～4層炎癥細(xì)胞圍繞氣道；4分，4層以上炎癥細(xì)胞圍繞氣道。

1.3.3.2 氣道黏液評(píng)分 PAS染色觀察氣道黏膜杯狀細(xì)胞增生及氣道黏液分泌情況，以PAS陽(yáng)性的杯狀細(xì)胞數(shù)占整個(gè)氣道上皮細(xì)胞的百分比表示，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，<5%；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，>75%。

1.3.3.3 肺組織膠原纖維的沉積 顯微鏡觀察肺組織Masson染色，通過Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算藍(lán)色纖維化面積及氣道面積，將它們的百分比作為評(píng)定肺組織中膠原纖維的沉積程度。

1.3.4熒光免疫組織化學(xué)法 大鼠肺組織蠟塊切片常規(guī)脫蠟，在加入檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)高壓鍋中修復(fù)抗原5 min；0.3%Triton-X 100室溫下孵育15 min，PBS洗3次，每次5 min；配制封閉液(二抗來源的血清50 μl+10%BSA 100 μl +PBS 850 μl)，室溫下封閉1 h；滴加一抗， 4 ℃冰箱過夜；次日恢復(fù)至室溫30 min后，PBS洗3次，每次5 min；生物素處理的二抗避光孵育1 h；PBS洗3次，每次5 min；DAPI染核5 min，PBS洗3次，每次5 min；防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集三組相同部位的肺組織，加入蛋白酶抑制的細(xì)胞裂解液提取總蛋白；BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度；12% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜上；5%封閉液室溫封閉蛋白1 h；一抗稀釋液稀釋抗體配制一抗工作液，4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液清洗3次；用一抗宿主來源相同的二抗工作液孵育PVDF膜，室溫孵育1 h；二抗孵育結(jié)束后，TBST洗膜3次，滴加ECL曝光顯影；顯色并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織炎癥評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況對(duì)照組大鼠支氣管管壁結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)且病理改變不明顯；哮喘組大鼠可見上皮下、支氣管周圍、肺泡間隔以及血管周圍大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)出現(xiàn)了支氣管管壁結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂，管壁增厚，氣道管腔狹窄，上皮下纖維化等改變，哮喘4周組和哮喘8周組大鼠肺組織炎癥評(píng)分及氣道壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組增多，且哮喘8周組亦較4周組增多(F=32.80，P<0.001；F=21.13，P=0.001 9)，見圖1。

圖1 大鼠肺組織炎癥評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況 HE×200A：HE染色結(jié)果；B：肺組織炎癥反應(yīng)評(píng)分；C：炎癥細(xì)胞總數(shù)；a:對(duì)照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組；與對(duì)照組比較：*P<0.01，**P<0.001；與哮喘4周組比較：#P<0.01，##P<0.001

2.2 氣道上皮中杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌情況PAS染色后，與對(duì)照組相比，哮喘組支氣管上皮細(xì)胞中PAS陽(yáng)性杯狀細(xì)胞面積較對(duì)照組增多；與哮喘4周組相比，哮喘8周組PAS陽(yáng)性細(xì)胞面積增加顯著(F=34.60，P<0.001)，見圖2。

圖2 氣道上皮中杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌情況 PAS×200A：PAS染色結(jié)果；B：肺組織黏液產(chǎn)生評(píng)分；a:對(duì)照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組；與對(duì)照組比較：**P<0.001；與哮喘4周組比較：##P<0.001

2.3 大鼠肺組織膠原纖維沉積情況Masson染色后，哮喘組與對(duì)照組比較，大鼠肺組織中膠原纖維沉積增加且隨著OVA致敏時(shí)間延長(zhǎng)，哮喘8周組膠原纖維沉積較哮喘4周組增加更明顯(F=12.76，P=0.026)，見圖3。

圖3 大鼠肺組織膠原纖維的沉積情況 Masson×200A：Masson染色；B：纖維化比值；a:對(duì)照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組；與對(duì)照組比較：*P<0.01；與哮喘4周組比較： #P<0.01

2.4 大鼠氣道平滑肌增生情況與對(duì)照組相比，哮喘組中氣道壁的α-SMA染色陽(yáng)性區(qū)域明顯增加，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，氣道重塑嚴(yán)重，與哮喘4周組比較，哮喘8周組中氣道壁α-SMA染色陽(yáng)性區(qū)域亦增加顯著(F=23.95，P<0.001)，見圖4和表1。

圖4 大鼠氣道平滑肌增生情況 ×100a:對(duì)照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組

表1 各組大鼠氣道平滑肌α-SMA染色陽(yáng)性區(qū)域面積

2.5 大鼠肺組織中組蛋白去甲基化酶KDM2A蛋白表達(dá)情況與對(duì)照組比較，哮喘組肺組織中KDM2A蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，與哮喘4周組相比，哮喘8周組KDM2A蛋白表達(dá)量亦增加(F=69.75，P<0.001)，見圖5。

圖5 大鼠肺組織中組蛋白去甲基化酶KDM2A蛋白表達(dá)情況A:對(duì)照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組；與對(duì)照組比較：**P<0.001；與哮喘4周組比較： ##P<0.001

2.6 KDM2A與氣道炎癥和氣道重塑相關(guān)性Pearson線性相關(guān)分析顯示：各組大鼠肺組織KDM2A蛋白表達(dá)與氣道炎癥評(píng)分、炎癥細(xì)胞總數(shù)、杯狀細(xì)胞黏液分泌評(píng)分、肺組織纖維化比值及氣道平滑肌增生面積呈正相關(guān)(P<0.001)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織KDM2A蛋白表達(dá)與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的相關(guān)性

3 討論

表觀遺傳學(xué)作為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，在支氣管哮喘中所發(fā)揮的作用越來越受到重視。它主要表現(xiàn)在DNA修飾、非編碼RNA調(diào)控以及組蛋白修飾三個(gè)方面。其中組蛋白修飾可以通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其主要包括組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化、磷酸化、泛素化、蘇木化以及瓜氨酸化等[5]。組蛋白甲基化對(duì)基因表達(dá)影響取決于甲基化殘基以及甲基化的程度和方向，而這個(gè)過程受蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶或者賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和賴氨酸去甲基化酶(lysine demethylases，KDMs)兩組酶的動(dòng)態(tài)調(diào)控[6]。KDM2A和其相似物KDM2B都是含有Jumonji C結(jié)構(gòu)域的組蛋白KDMs，它們是哺乳動(dòng)物中僅有的兩種賴氨酸去甲基化酶KDMs，可催化組蛋白H3K36me2去甲基化，從而激活轉(zhuǎn)錄基因[3]。眾多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)KDM2A在細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生及人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)等方面具有重要作用[3,7]，但是其在哮喘氣道炎癥及氣道重塑的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究通過OVA致敏誘導(dǎo)大鼠哮喘模型，觀察哮喘大鼠肺組織與對(duì)照組KDM2A表達(dá)變化，探討KDM2A與哮喘氣道炎癥及氣道重塑之間的關(guān)系。結(jié)果顯示：哮喘組大鼠肺組織KDM2A蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組，且隨著致敏時(shí)間延長(zhǎng)，哮喘8周組KDM2A蛋白表達(dá)較哮喘4周組明顯升高，結(jié)果提示KDM2A可能參與哮喘發(fā)生發(fā)展過程。

氣道炎癥及氣道重塑是支氣管哮喘的主要病理特征，多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是哮喘慢性氣道炎癥主要病理生理表現(xiàn)[4]。KDM2A是調(diào)控組蛋白H3K36、H3K14去甲基化的重要基因，在小鼠哮喘模型及哮喘患者肺組織中，表達(dá)增高的組蛋白H3K36、H3K14參與氣道炎癥及氣道重塑的發(fā)生[8]。KDM2A在不同組織表達(dá)量不同，特別在肺、大腦、睪丸及卵巢等組織表達(dá)量明顯增高。高表達(dá)KDM2A后，滑膜細(xì)胞增殖增加，促進(jìn)炎癥介質(zhì)分泌增加[9]。同時(shí)，作為KDM2家庭成員之一的KDM2B介導(dǎo)白介素6產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)過程，在KDM2B基因敲除小鼠中，炎癥表型較輕、血清炎癥介質(zhì)IL-6產(chǎn)生減少[10]。這些研究結(jié)果均提示KDM2A作為組蛋白去甲基化調(diào)節(jié)的主要基因，在炎癥調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示：哮喘組大鼠肺組織上皮下、支氣管周圍、肺泡間隔以及血管周圍大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜充血腫脹，上皮細(xì)胞脫落壞死，炎癥細(xì)胞總數(shù)增多。此外，本研究提示大鼠肺組織KDM2A表達(dá)與氣道炎癥評(píng)分、炎癥細(xì)胞總數(shù)、黏液分泌評(píng)分呈正相關(guān)，提示KDM2A與支氣管哮喘氣道炎癥關(guān)系密切，推測(cè)其可能通過調(diào)控炎癥細(xì)胞的分化和浸潤(rùn)，從而促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，加劇氣道炎癥過程。

氣道重塑主要是氣道壁結(jié)構(gòu)的改變，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞脫落壞死、基底膜增厚、杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌增多、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移以及氣道血管生成及血管重塑[4]。KDM2A調(diào)控組蛋白H3K36的甲基化，組蛋白H3K36參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因劑量補(bǔ)償、pre-mRNA剪接、DNA復(fù)制、重組和DNA損傷修復(fù)等過程[11-12]。在心肌梗死小鼠模型中，KDM2A上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞血管生成及抑制心肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)心室重構(gòu)[13]。在卵巢癌細(xì)胞中，KDM2A參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程[14]。已有研究證實(shí)蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT1抑制劑(AMI-1)可以降低ASMCs增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和細(xì)胞遷移；減少大鼠肺組織氣道和肺泡病變、黏液分泌和膠原沉積，即蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT1參與哮喘氣道重塑[15]。那么作為組蛋白甲基化另一種關(guān)鍵酶賴氨酸去甲基化酶KDMs是否也參與哮喘氣道重塑的調(diào)控呢？本研究結(jié)果顯示，哮喘組大鼠肺組織KDM2A表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，且隨著致敏時(shí)間延長(zhǎng)，該因子表達(dá)量亦逐漸增加。本研究通過分析哮喘大鼠與KDM2A表達(dá)與氣道重塑的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)哮喘大鼠模型KDM2A的表達(dá)與氣道壁纖維化比值、氣道平滑肌的面積呈正相關(guān)，由此推測(cè)KDM2A可能通過促進(jìn)氣道血管生成，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等方式參與氣道重塑的過程，但具體的機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步顯示組蛋白去甲基化酶KDM2A與支氣管哮喘的發(fā)病有著密切關(guān)系，為表觀遺傳學(xué)在支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制方面開辟了新的思路，而KDM2A參與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的具體機(jī)制，仍需深入研究。