母體孕期維生素D缺乏對胎盤甾體激素合成的影響

付 林，陳遠華，徐德祥

胎兒宮內生長受限(fetal intrauterine growth restriction, IUGR) 是指受病理因素影響，胎兒出生未能達到其遺傳決定的全部生長潛能[1]。在美國和歐洲，IUGR的發生率為5%～15%，而在中國IUGR的發生率為6%～10%[2-3]。IUGR不僅增加了死胎發生風險，同時也是誘發圍產期胎兒高發病率和死亡率的主要原因[4]。此外，IUGR還會增加成年期慢性疾病的風險，研究[5-6]表明，IUGR胎兒在成年期以后易患Ⅱ型糖尿病、中心性肥胖、心血管疾病、代謝性疾病以及神經發育受損等。

維生素D缺乏(vitamin D deficiency, VDD)，指血清中25-(OH)-D的水平低于20 ng/ml，近年來母體孕期維生素D缺乏與不良妊娠結局的關系受到越來越多的關注，流行病學研究[7-9]表明母體孕期維生素D缺乏增加了死胎、流產以及早產的發生風險，但是維生素D缺乏誘發IUGR具體機制不清楚。因此，該研究旨在通過低維生素D飼料喂養構建VDD誘發IUGR孕鼠模型，并從甾體激素合成方面探討VDD誘發IUGR的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級CD-1系成年雌鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2017-0007。4周齡雌鼠體質量18～20 g，飼養在恒溫恒濕鼠房中，自由進食和飲水，保持恒定的晝夜節律。動物實驗遵從安徽醫科大學實驗動物科學協會和實驗動物科學中心的管理章程，符合動物倫理學的規定。

1.1.2藥物與試劑 雌激素和孕激素檢測試劑盒購于北京美正生物科技有限公司。核因子E2相關因子(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2；貨號：ab62352)、NADPH氧化酶2 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2，NOX-2；貨號：ab80508)、細胞色素P450家族成員11A1 (cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1，CYP11A1；貨號：ab67355)和β-actin (貨號: ab179467)一抗購于美國Abcam公司；NADPH氧化酶2 (NOX-4；貨號：D21F6)、血紅素氧合酶1 (heme oxygenase-1，HO-1；貨號：E9H3A)和血紅素氧合酶2 (HO-2；貨號：D9J9U)一抗均購于美國Cell Signaling Technology公司；芳香化酶p450 (aromatase cytochrome P450，CYP19；貨號：SC14245)、3β-羥基類固醇脫氫酶 (3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD2；貨號：SC28206)和3-硝基酪氨酸 (3-nitrotyrosine，3-NT；貨號：SC32757)一抗購于美國Santa Cruz公司。RNA提取試劑盒由美國Promega公司提供，逆轉錄試劑由瑞士Roche公司提供，PVDF膜由美國Millipore公司提供，ECL顯色液由美國Advansta公司提供，免疫組化試劑盒由北京中山金橋生物技術有限公司提供。其他常規試劑均購自美國Abcam公司。

1.1.3儀器 Fine Do X6全自動化學發光分析系統(上海天能科技有限公司)，LightCycler?480定量PCR儀 (美國Roche公司)，Senergy2多功能酶標儀(美國BioTek公司)，Universal32R低溫高速離心機(德國Hettich科學儀器公司)，UV-1200型紫外可見分光光度計(中國上海翱藝有限公司)，光學顯微鏡和DP71成像系統(日本Olympus公司)。

1.2 動物模型的制備小鼠適應性喂養1周以后，隨機均分成對照組(CTRL組)和維生素D缺乏組(VDD組)。CTRL組小鼠喂養標準飼料(維生素D含量大于800 IU/kg)，VDD組小鼠飼養在無紫外光的環境中，并喂以低維生素D飼料(維生素D含量小于25 IU/kg)。正常飼料和低維生素D飼料購于北京科奧協力有限公司。飼養5周以后，于晚上9:30按照4只雌鼠與2只正常雄鼠合籠交配，次日早上7:30檢查陰栓，以陰道口查到黃色栓狀固體分泌物視為交配成功。查到陰栓的天數記為妊娠第1天，在妊娠第16天剖殺部分孕鼠，取母鼠血液檢測血清甾體激素水平，留取胎盤進行蛋白免疫印跡(Western blot)、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫組織化學檢測；在妊娠第19天剖殺剩余孕鼠，取胎血檢測血清25-(OH)-D水平，統計活胎、死胎以及吸收胎數，稱取胎鼠和胎盤重量，量取胎鼠身長和胎盤直徑。

1.3 胎盤總蛋白的提取及Western blot實驗剪取3/4個胎盤組織到含有500 μl蛋白裂解液的電動勻漿器中，冰上快速勻漿30 s，結束后轉移到1.5 ml離心管中，插入冰盒中靜置12 min，然后在4 ℃離心機中15 000 r/min離心10 min，然后吸取上清液300 μl至新的EP管中，冰盒上繼續靜置5 min，然后4 ℃離心機中10 000 r/min繼續離心5 min，吸取上清液250 μl，煮沸變性10 min，所得即為小鼠胎盤組織總蛋白，分裝于-80 ℃超低溫冰箱中保存。接下來進行SDS-PAGE電泳，取下PVDF膜，清洗干凈，牛奶封閉，孵育一抗(1 ∶2 000稀釋)和二抗(1 ∶10 000稀釋)[10]，PBS漂洗干凈，加入ECL發光液，然后自動發光顯影，拍照并分析目的條帶灰度值，計算目的蛋白表達量。

1.4 放射免疫分析法用放射免疫法檢測血清中孕激素、雌激素以及25-(OH)-D的水平。試劑盒于室溫中復溫30 min，稀釋標準品，構建標準曲線。然后在玻璃管中加入500 μl乙腈、標準品、質控和待測樣品。劇烈震蕩20 s，室溫下3 000 r/min離心10 min，吸取上清液50 μl至新的玻璃管中，加入125I 放射試劑，然后加入抗體，震蕩混勻，孵育30 min后，加入二抗復合物，繼續孵育30 min，然后于放射免疫分析儀中檢測其放射強度，根據已知的標準曲線換算血清中雌激素、孕激素和25-(OH)-D的水平。

1.5 免疫組織化學法取部分小鼠胎盤組織，將其固定于4%多聚甲醛溶液中，期間不停晃動樣品管，固定24 h后液體石蠟包埋胎盤組織，切片。石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液(從高到低)水化，PBS洗片。TritonX-100通透液(含有雙氧水)通透50 min，然后在微波爐中加熱檸檬酸鈉溶液進行抗原修復。抗原修復完成后，進行冷卻。然后加入血清，濕盒中封閉2 h，吸干血清，無需清洗，直接加入一抗，4 ℃冰箱中孵育過夜，回收一抗，加入二抗工作液，37 ℃恒溫箱中繼續孵育1.5 h，然后將切片在PBS中漂洗干凈，繼續SP反應1 h，最后DAB顯色，在封閉避光的房間中操作，在顯微鏡下實時觀察顯色情況，出現棕黃色或棕褐色及時終止反應。然后洗凈切片，蘇木精復染，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察Nrf-2陽性細胞核數。

2 結果

2.1 低維生素D飼料喂養構建維生素D缺乏動物模型為驗證VDD模型是否成功建立，檢測母鼠血清25-(OH)-D水平。結果顯示，VDD組母鼠血清25-(OH)-D(5.7±0.44 ng/ml)顯著低于CTRL組(17.5±0.56 ng/ml)。以上結果表明，5周連續的低維生素D飼料喂養，成功構建維生素D缺乏小鼠模型。

2.2 母體孕期維生素D缺乏誘發IUGR在孕第19天剖殺孕鼠，觀察妊娠結局。結果如表1所示，與CTRL組相比，VDD組活胎數減少(t=1.123，P<0.05)，晚死胎數增加(t=1.123，P<0.05)，早死胎數和吸收胎數在兩組之間無差異。稱量胎鼠和胎盤重量，結果顯示VDD組胎鼠重量 (t=2.517，P<0.01)和胎盤重量(t=5.073，P<0.01)均是低于CTRL組。測量胎鼠身長和胎盤直徑，發現VDD組胎鼠身長 (t=1.830，P<0.01)和胎盤直徑(t=1.831，P<0.01)均低于CTRL組。

表1 兩組孕鼠出生結局

2.3 母體孕期維生素D缺乏上調胎盤雌激素合成通過Western blot法檢測小鼠胎盤雌激素合成關鍵酶CYP19的蛋白表達水平，結果如圖1所示，VDD組小鼠胎盤CYP19蛋白表達水平高于CTRL組(圖1A、1B)，差異有統計學意義(t=4.532，P<0.01)。此外，檢測小鼠胎盤孕激素合成關鍵酶蛋白表達水平，結果提示孕激素合成關鍵酶CYP11A1和3β-HSD2蛋白表達在CTRL和VDD兩組之間無差異 (圖1A、1C、1D)。通過免疫放射分析法檢測兩組孕鼠血清中雌激素和孕激素水平，結果提示，盡管孕激素水平在兩組孕鼠之間差異無統計學意義，但是雌激素水平在VDD組孕鼠中顯著升高(t=2.637，P<0.01)，見圖1E、1F。

圖1 母體孕期維生素D缺乏對小鼠甾體激素的影響A：胎盤CYP19、CYP11A1和3β-HSD2蛋白條帶；B：CYP19蛋白條帶定量分析；C：CYP11A1蛋白條帶定量分析; D：3β-HSD2蛋白條帶定量分析; E：孕鼠雌激素水平；F：孕鼠孕激素水平；與CTRL組比較：**P<0.01

2.4 母體孕期維生素D缺乏誘發胎盤氧化應激通過Western blot法檢測小鼠胎盤氧化應激相關蛋白表達水平，結果如圖2所示，盡管HO-2蛋白在兩組之間表達差異無統計學意義 (圖2A、2B)，但是HO-1表達水平在VDD組小鼠胎盤中升高(t=6.102，P<0.01)，見圖2A、2B；同時，小鼠胎盤中NADPH氧化酶水平檢測結果提示，維生素D缺乏對小鼠胎盤NOX-2表達無影響(圖2)，但是維生素D缺乏明顯上調了小鼠胎盤NOX-4表達(t=2.655，P<0.01) ，見圖2A、2B；小鼠胎盤3-NT蛋白水平檢測結果表明，3-NT蛋白在VDD組表達升高(t=3.654，P<0.01) ，見圖2。此外，免疫組織化學法檢測小鼠胎盤Nrf-2的核轉位水平結果顯示，VDD組小鼠胎盤中Nrf-2核轉位水平明顯升高(t=5.318，P<0.01) ，見圖3A、3B。

圖2 母體孕期維生素D缺乏對小鼠胎盤氧化應激的影響A:胎盤HO-1、HO-2、NOX-2、NOX-4和3-NT蛋白條帶；B：蛋白條帶定量分析；與CTRL組比較：**P<0.01

圖3 母體孕期維生素D缺乏對小鼠胎盤Nrf-2核轉位的影響A：免疫組化檢測小鼠胎盤Nrf-2的核轉位；B：Nrf-2陽性細胞核數；與CTRL組比較：**P<0.01

3 討論

本研究通過在無紫外光照環境中，連續5周低維生素D飼料喂養小鼠構建VDD小鼠模型，結果顯示VDD組小鼠血清25-(OH)-D水平顯著低于對照組，表明VDD小鼠模型被成功構建。進一步將VDD雌鼠與正常雄鼠交配，結果顯示VDD組活胎數減少，晚死胎數增多，VDD組胎鼠和胎盤重量顯著減輕，胎鼠身長和胎盤直徑明顯降低。以上結果表明，母體孕期維生素D缺乏可誘發IUGR，但是具體機制不明。

越來越多的研究表明，雌激素和孕激素是人體中重要的甾體類固醇激素，在妊娠過程中發揮著重要作用。妊娠早期孕激素和雌激素主要由黃體產生，而在妊娠中、晚期可由胎盤合體滋養細胞合成和分泌，正常水平的雌激素和孕激素對胎盤功能維持和胎兒生長發育發揮重要作用[11]。在正常妊娠過程中，母血中雌激素會出現短暫的、生理性的升高，但是在妊娠早起，過高的雌激素會抑制絨毛外血管內皮生長因子表達和子宮螺旋動脈的浸潤，抑制胎盤的發育，進而導致IUGR[12]。CYP19是一種重要的雌激素合成限速酶，調節雌激素的合成。本研究顯示，CYP19蛋白在VDD胎盤中表達顯著升高；此外，VDD組孕鼠血清雌激素水平升高，而孕激素合成限速酶以及孕激素水平在無明顯改變。以上實驗結果提示，母體孕期維生素D缺乏可通過促進胎盤雌激素合成，升高母體內雌激素水平抑制胎盤的發育和功能進而導致IUGR。

氧化應激是指機體內活性氧的過量產生和機體內抗氧化能力的不平衡，活性氧是機體內游離的自由基，會導致氧化還原狀態失衡，引起脂質過氧化、蛋白質羰基化以及DNA損傷等[13]。已有研究[13]表明，胎盤的氧化應激在IUGR的病理過程中發揮著重要作用。機體內活性氧的過量產生，可抑制胎盤的血管重構和營養物質的攝取和運輸，改變激素的合成，損傷胎盤功能和胎兒發育，誘發IUGR。而本研究發現母體孕期維生素D缺乏上調胎盤HO-1、NOX-4和3-NT蛋白達水平，促進胎盤Nrf-2核轉位水平，以上結果表明孕期母體維生素D缺乏誘發胎盤氧化應激，損傷胎盤的發育。提示孕期母體維生素D缺乏可能通過誘發氧化應激促進胎盤雌激素合成而導致IUGR，然而，維生素D缺乏誘發胎盤氧化應激的作用機制目前并不清楚。

Nrf-2是細胞對抗氧化損傷的重要作用機制之一，通過調節細胞保護基因的表達，維持細胞正常功能。Nrf-2的表達主要受細胞內泛素化過程和蛋白酶體降解系統調節，在靜息狀態下，Nrf-2與滯蛋白-3型泛素連接酶接頭蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)相結合而錨定在細胞質中，而當細胞內部受到活性氧或親電體刺激后，可引發Keap1構象改變并導致Nrf-2游離出來，轉位進入細胞核與抗氧化反應元件 (antioxidant response element, ARE)結合發揮轉錄因子作用，調節下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化及抗炎蛋白表達[14]。維生素D可通過維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)激活細胞內的Nrf-2抗氧化系統，抵抗胞內氧化應激和炎癥反應[15]。而維生素D缺乏常導致VDR核轉位減少，細胞核內VDR表達降低，進而誘發機體氧化應激[16]。因此，有理由推測母體孕期維生素D 缺乏通過誘發胎盤氧化應激，導致過多的活性氧產生，損傷胎盤功能和促進胎盤雌激素合成，進而誘發IUGR。

綜上所述，母體孕期維生素D缺乏導致IUGR，其作用機制可能是維生素D缺乏誘發胎盤氧化應激，導致機體內活性氧過量產生，上調胎盤CYP19表達、促進雌激素合成，進而誘發IUGR。本研究為母體孕期維生素D缺乏誘發IUGR的機制提供了新的證據。