miR-1285通過YAP對慢性粒細胞白血病K562細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制

張紅霞，吳廣勝

慢性粒細胞性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種骨髓增生性腫瘤，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKI)作為CML治療的臨床一線用藥，仍有許多患者對TKIs發(fā)生耐藥[1]。CML與Wnt、Notch、Hippo等信號通路的失調(diào)相關(guān)[2]。轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1, YAP1)是Hippo信號通路中的癌基因，在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用[3]。YAP參與了癌癥惡性行為的維持[4-6]，有研究[7]顯示抑制YAP的表達，CML細胞生長減慢增加藥物的敏感性，另有研究[8]表明YAP的磷酸化水平與CML細胞生長成正比。

近年來微小RNA(microRNA，miRNA)在調(diào)控基因表達、腫瘤發(fā)生及發(fā)展發(fā)揮了重要作用[9]。miR-1285，也稱為miR-1285-1，miR-1285-3p，位于7q21-q22中[10]。miR-1285在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用[11]，而在CML中的作用尚不清楚。CML中許多microRNA處于失衡狀態(tài)，多項研究[12]證明這些microRNA在調(diào)節(jié)白血病細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用，但是否會作用于YAP這條通路尚無有力證據(jù)。因此該研究主要側(cè)重于miR-1285通過靶向YAP對慢性粒細胞白血病K562細胞的增殖、凋亡以及對其作用機制的初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒(Thermo Fisher公司)，CCK8檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(Abcam公司)，RIPA細胞裂液(BOSTER公司)，1%青鏈霉素、10%胎牛血清(Gibco公司)，質(zhì)粒(上海Genepharma公司)，具體序列見表1。

表1 質(zhì)粒序列

1.2 K562細胞的制備慢性粒細胞白血病K562細胞購于武漢普諾賽公司，使用含1%青鏈霉素10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h進行更換培養(yǎng)基處理并1 ∶2傳代。選擇對數(shù)期生長的細胞進行下一步實驗細胞。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染使用Lippofectamine 3000作為載體。

1.3 CCK-8法檢測K562細胞增殖情況按5×105/ml密度將K562細胞種植在24孔板中并設(shè)置空白組，培養(yǎng)12 h后，每組設(shè)置3個對照組，將質(zhì)粒與K562細胞共培養(yǎng)48 h與72 h后，每孔加入25 μl CCK-8試劑，避光，37 ℃條件中孵育1.5 h，測定酶標儀在450 nm吸光度時的吸光度(A)值，以此來計算細胞的增殖率。計算方法：增殖率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.4 流式細胞儀檢測K562細胞凋亡情況按5×105/ml密度將K562細胞種植在6孔板中，按照1.3項處理后的K562細胞使用預(yù)冷的PBS沖洗干凈后，加入胰酶消化后收集細胞，離心獲得沉淀，使用PBS重懸細胞后分裝，分別加入PI和Annexin V-FITC抗體后，設(shè)置對照組，避光情況下上機檢測。

1.5 實時熒光定量PCR檢測K562細胞中miR-1285的表達水平按照1.3項處理后的K562細胞，TRIzol法提取細胞中總RNA，調(diào)平后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 2 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。將所得cDNA進行實時熒光定量PCR，所用PCR引物序列見表1。擴增條件為:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)次數(shù)40次。使用2-ΔΔCt計算公式得出mRNA的表達量。

1.6 Western blot法測定蛋白表達量按照1.3項處理后的K562細胞加入RIPA細胞裂解液，獲取K562細胞中總蛋白樣品，用BCA法檢測上樣蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后使各組濃度一致，然后使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入兔抗鼠單克隆抗體YAP、P-EGFR、EGFR、BAX、Bcl-2、GAPDH(稀釋比1 ∶800)于4 ℃條件下孵育24 h后，充分去除一抗并于常溫條件下加入山羊抗兔二抗(稀釋比1 ∶20 000)孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法檢測各分子的蛋白表達情況，使用Image J軟件處理灰度值并計算相對蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后K562細胞內(nèi)miR-1285 mRNA的表達量在轉(zhuǎn)染后48 h檢測細胞內(nèi)miR-1285的表達量，與mimics control組比較，miR-1285 mimics組表達升高，與inhibitor control組比較，miR-1285 inhibitor組表達下降(P<0.05)。而mimics control組與inhibitor control組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 不同處理組miR-1285表達情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

2.2 過表達miR-1285后抑制K562細胞增殖轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h，與miR-1285 inhibitor組比較，miR-1285 inhibitor組、mimics control組、inhibitor control組均可促進K562細胞增殖(P<0.05)；而通過過表達miR-1285，miR-1285 mimics組較mimics control組增殖減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在相同的培養(yǎng)環(huán)境下，miR-1285 inhibitor組細胞增殖明顯高于inhibitor control組(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同處理組K562細胞增殖情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

圖3 不同處理組K562細胞凋亡情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

2.4 凋亡相關(guān)分子BAX、Bcl-2的蛋白表達Western blot結(jié)果顯示，與mimics control組比較，mimics組BAX升高，而Bcl-2降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而與inhibitor control組比較，miR-1285 inhibitor組的BAX表達降低，而Bcl-2表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同處理組K562凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2表達情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

2.5 YAP及EGFR下游相關(guān)分子的蛋白表達Western blot結(jié)果顯示，過表達miR-1285后，YAP的表達下降，而敲低miR-1285會使YAP的表達上升；與mimics control組比較，miR-1285 mimics組的YAP、P-EGFR表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與inhibitor control組比較，miR-1285 inhibitor組的YAP、P-EGFR表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組之間EGFR未見明顯變化，見圖5。

圖5 不同處理組K562細胞中YAP、EGFR、P-EGFR的表達情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

3 討論

近年來關(guān)于microRNA的研究逐漸增多，其中在抑制腫瘤方面有較多發(fā)現(xiàn)。有研究[13]顯示在CML中使用YAP抑制劑維替泊芬可抑制其凋亡，促進增殖。本研究顯示使用miR-1285質(zhì)粒后，使miR-1285表達增加時，K562細胞增殖減弱，而凋亡增加；相同條件下使miR-1285下調(diào)后，K562細胞出現(xiàn)增殖明顯而抑制凋亡。這與Huang et al[14]在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-1285過表達后其抑制惡性生物學(xué)行為，可能是抑制了YAP的表達；而使miR-1285降低時，可得到相反的結(jié)果。

通過過表達或敲低miR-1285，可以觀察到K562細胞中miR-1285表達升高及降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義,證明可有效建立細胞模型。當過表達miR-1285后，與inhibitor組相比，K562細胞凋亡增加，而使miR-1285表達降低時，細胞凋亡降低，可能是由于過表達miR-1285后可抑制YAP的表達從而使K562細胞增殖減弱，進而凋亡增加，當使miR-1285表達降低后對YAP的抑制作用減弱，YAP表達增加，促進K562細胞的增殖，抑制凋亡。這與相關(guān)研究[13]結(jié)果一致。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，過表達miR-1285后，K562細胞增殖減弱，而敲低miR-1285后，可促進miR-1285的增殖，增殖結(jié)果與流式結(jié)果相一致；其原因也與上述一致，可能是由于抑制或促進YAP的表達進而影響了K562細胞的增殖。

對凋亡相關(guān)分子BAX與Bcl-2進行測定，結(jié)果顯示mimics組BAX表達量升高，且明顯高于其余三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；當抑制miR-1285后，BAX的表達量較對照組下降，明顯低于mimics組；而與之對應(yīng)的促增殖因子Bcl-2在mimics組中表達明顯低于三組，而在inhibitor組中Bcl-2表達高于其余三組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；說明miR-1286可通過一系列信號通路作用于K562細胞的線粒體通路從而影響增殖與凋亡，過表達miR-1285后，細胞增殖能力減弱，可能是因為抑制了Bcl-2而促進BAX的表達，通過線粒體通路來影響細胞增殖情況。而敲低miR-1285后，這種抑制作用減弱，對線粒體凋亡通路影響較小，因此促進細胞增殖。然而這種是通過何種機制來發(fā)揮作用的不得而知。

有研究[15]顯示miR-1285可通過YAP信號通路可調(diào)控卵巢癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。而另有一項研究[7]證明YAP抑制劑可作用于K562細胞介導(dǎo)Hippo信號通路抑制增殖、促進凋亡。miRNA在CML中的研究較少，但YAP對CML的作用已有大量研究[16]證實，因此筆者猜想miR-1285是否也能作用于YAP進而影響K562細胞的生物學(xué)行為，對增殖、凋亡有何影響。本研究結(jié)果顯示使miR-1285過表達后可抑制YAP的表達，通過對下游分子檢測P-EGFR表達也下降，而非磷酸化的EGFR未見明顯變化；當使miR-1285敲低后，這種抑制作用會減弱，相比對照組YAP的表達升高，下游分子P-EGFR的表達隨之升高，而相應(yīng)的非磷酸化EGFR表達不變，發(fā)生這種情況的原因可能是由于miR-1285作用于YAP使表達降低，進而抑制對下游分子的激活作用，使下游分子呈現(xiàn)出非磷酸化，而使miR-1285表達降低后，這種抑制作用會降低，影響其他分子對YAP的抑制作用，使YAP表達升高，再通過一系列信號通路影響K562細胞的線粒體凋亡通路，抑制BAX的表達，使Bcl-2的表達升高，促進增殖，抑制凋亡。

綜上所述，YAP的表達異常參與了多種腫瘤細胞及血液系統(tǒng)疾病的生物學(xué)行為進程，與疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸均密切相關(guān)。miR-1285又可以通過作用于YAP使YAP表達異常，在CML細胞的增殖、凋亡方面發(fā)揮了重要作用。為后期研究microRNA在CML的作用機制提供思路，為后期靶向治療提供新方向，可設(shè)計針對于CML的microRNA，為該病后期治療提供一種新的靶向藥物。