過表達miR-203a-3p對脂多糖致大鼠急性肺損傷后肺纖維化的影響及其機制

任亦頻，周厚榮，李亞騏，黃 佳

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由多種因素所導(dǎo)致的急性、進行性、缺氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭[1]。ALI的病因多樣，發(fā)病機制復(fù)雜，其中過度炎癥反應(yīng)已被公認是引發(fā)ALI發(fā)病的重要原因之一[2]。ALI具有較高的發(fā)病率，目前仍缺乏有效的治療手段。ALI后肺部組織會發(fā)生成纖維細胞聚集、膠原沉積等纖維增生反應(yīng)，最終形成肺間質(zhì)纖維化。微小RNA(miRNAs)是由19～25個核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游靶基因的表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種重要的生命活動[3]。眾所周知，miRNA在機體的炎癥反應(yīng)過程中也發(fā)揮重要作用，并且與ALI的發(fā)病密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-203a-3p參與調(diào)節(jié)肺水腫[5]、膿毒性休克肺損傷[6]、肺纖維化[7]等病癥，然而其具體機制尚不完全清楚。為此，本研究通過脂多糖誘導(dǎo)建立大鼠ALI模型，探究miR-203a-3p對大鼠ALI后肺纖維化的影響及機制，旨在為臨床治療肺損傷后肺纖維化提供潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡健康SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g ，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK(湘)2019-2004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25 ℃，相對濕度50～65%，保持自然晝夜(12 h光照/12 h黑暗)處理，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑及儀器脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；miR-203a-3p 模擬物(mimic)及其陰性對照(mimic NC)和miR-203a-3p 激動劑(agomir)及激動劑對照(agomir-NC)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol 提取液、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；PCR引物購自上海 Bio-TNT 生物公司；羥脯氨酸(HYP)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗卵泡抑素樣蛋白1(follistatin-like 1，F(xiàn)stl1)抗體、β-actin抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自美國CST公司；低溫冷凍干燥離心機購自德國Eppendorf公司；石蠟切片機購自德國LEICA公司；蛋白印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司；熒光定量擴增PCR儀器購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1大鼠ALI后早期肺纖維化模型建立 取60只SD大鼠隨機分為4組：對照組、模型組、agomir陰性對照組(agomir-NC組)和miR-203a-3p agomir組(agomir組)，每組15只。參照文獻[8]改良的方法構(gòu)建大鼠ALI后早期肺纖維化模型，先經(jīng)口氣管注入含1.5 mg/kg LPS的生理鹽水溶液，24 h后腹腔內(nèi)注入含3 mg/kg LPS的生理鹽水溶液，48 h后再經(jīng)口氣管注入含3 mg/kg LPS的生理鹽水溶液，而對照組注入等量生理鹽水。agomir-NC組和agomir組大鼠在造模前1 d及造模后1周，分別經(jīng)尾靜脈注射200 μl的agomir-NC和miR-203a-3p agomir，劑量為10 nmol/只。于造模后第14天處死大鼠，取材進行檢測。

1.3.2肺組織病理學(xué)觀察及纖維化程度的評估 取大鼠左肺上葉組織，用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后制成4 μm厚切片，HE染色后于光學(xué)顯微鏡200倍視野下選取10個視野觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，參考文獻[9]對肺損傷程度進行半定量測評，總分為0～16分，分數(shù)越高表示肺組織損傷越嚴重。對制備的大鼠肺組織切片進行Masson染色，于光學(xué)顯微鏡200倍視野下選取10個視野進行觀察，參照Ashcroft制定的0～5分評分法[10]對大鼠肺組織纖維化程度進行半定量測評，分數(shù)越高肺組織纖維化程度越嚴重。

1.3.3肺組織濕/干比重(W/D)測定 取各組大鼠右肺中葉及下葉組織100 mg，濾紙沾干表面水分，天平稱濕重；然后置于烘箱中，60 ℃烘烤72 h，天平秤干重，進行濕/干質(zhì)量比(W/D)計算。

1.3.4肺組織Hyp水平的測定 精確稱取0.2 g新鮮的右肺組織置于玻璃管中，使用玻璃棒碾碎，加入2 ml提取液，置于100 ℃烘箱中充分消化，16 000 r/min室溫離心25 min，取上清液，調(diào)整pH值至6～8，蒸餾水定容至4 ml，取上清液按照試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，混勻后置于60 ℃水浴20 min，取200 μl溶液采用酶標(biāo)儀于560 nm處測量吸光值，再根據(jù)說明書提供的公式計算肺組織中Hyp含量。

1.3.5ELISA檢測大鼠肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、IL-6和TNF-α水平 將麻醉后大鼠仰臥固定，打開大鼠胸腔，心臟穿刺放血處死，然后結(jié)扎右側(cè)肺門，分離出頸部氣管，插入導(dǎo)管，2.5 ml生理鹽水反復(fù)沖洗3次，收集灌洗液，于4 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，取上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測BALF 中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.3.6qRT-PCR檢測大鼠肺組織中miR-203a-3p和Fstl1 mRNA表達水平 采用TRIzol法提取大鼠肺組織總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，參照qRT-PCR試劑盒說明書反應(yīng)體系進行qRT-PCR反應(yīng)，各基因引物信息如表1所示。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，進行45個循環(huán)。miR-203a-3p以U6為內(nèi)參，F(xiàn)stl1以β-actin為內(nèi)參，miR-203a-3p和Fstl1 mRNA相對表達水平采用2-ΔΔCt法進行計算。

表1 各基因引物信息

1.3.7Western blot檢測大鼠肺組織中Fstl1蛋白表達水平 取各組大鼠肺組織加入適量RIPA裂解液充分裂解30 min，置于4 ℃條件下14 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白沸水浴變性后進行10% SDS-PAGE電泳，并采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Fstl1抗體(1 ∶1 000)和β-actin抗體(1 ∶1 000)，于4 ℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，滴加ECL顯影，并采用ImageJ軟件對各條帶進行灰度值分析。

1.3.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?通過TargetScan在線軟件預(yù)測miR-203a-3p與Fstl1 3′UTR區(qū)域結(jié)合位點。構(gòu)建Fstl1 3′UTR野生型(WT)和Fstl1 3′UTR突變型(MUT)熒光素酶報告基因質(zhì)粒。取對數(shù)生長期的293T細胞，接種于12孔板，當(dāng)細胞匯合度約70%時對細胞進行分組，使用Lipofectamine 2000分別將其與mimic NC和miR-203a-3p mimic共轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染48 h，按照試劑盒說明書要求，分別檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性，用二者比值表示熒光酶相對活性。

2 結(jié)果

2.1 肺組織形態(tài)學(xué)觀察如圖1所示，Control組大鼠肺泡形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰完整，無明顯藍色膠原纖維染色；Model組和agomir-NC組大鼠肺泡腔塌陷、水腫，伴有炎癥滲出物和出血，肺泡間隔變寬變厚，且藍色膠原纖維染色明顯，存在致密的膠原沉積；agomir組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡壁增厚及水腫程度均較模型組有所改善，炎性細胞浸潤及出血情況明顯減少，藍色膠原纖維染色較淺，膠原沉積減少。如表2所示，與Control組比較，Model組大鼠肺組織損傷評分及纖維化評分增加(P<0.05)；與Model組比較，agomir組大鼠肺損傷評分及纖維化評分降低(P<0.05)，而agomir-NC組大鼠肺損傷評分及纖維化評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠肺組織損傷及纖維化評分分，n=15)

圖1 肺組織HE和Masson染色 ×200

2.2 各組大鼠肺組織W/D值及Hyp水平如表3所示，與Control組比較，Model組大鼠肺組織W/D值及Hyp水平增加(P<0.05)；與Model組比較，agomir組大鼠肺組織W/D值及Hyp水平降低(P<0.05)，而agomir-NC組大鼠肺組織W/D值及Hyp水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠肺組織W/D值及Hyp水平比較

2.3 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平如表4所示，與Control組比較，Model組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)；與Model組比較，agomir組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)，而agomir-NC組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平

2.4 大鼠肺組織中miR-203a-3p和Fstl1表達水平如表5和圖2所示，與Control組比較，Model組大鼠肺組織中miR-203a-3p表達水平降低(P<0.05)，而Fstl1 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。與Model組比較，agomir組大鼠miR-203a-3p表達水平升高(P<0.05)，F(xiàn)stl1 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)，而agomir-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 各組大鼠miR-203a-3p及Fstl1 mRNA和蛋白表達水平

圖2 Western blot檢測各組大鼠肺組織中Fstl1蛋白表達水平A：Control組；B：Model組；C：agomir-NC組；D：agomir組

2.5 miR-203a-3p與Fstl1靶向關(guān)系的驗證如圖3所示，TargetScan軟件預(yù)測miR-203a-3p與Fstl1 3′UTR區(qū)域存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證，與共轉(zhuǎn)染mimic-NC和Fstl1-WT質(zhì)粒組細胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic和Fstl1-WT質(zhì)粒組細胞相對熒光素酶活性降低(P<0.05)；與共轉(zhuǎn)染mimic-NC和Fstl1-MUT質(zhì)粒組細胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic和Fstl1-MUT質(zhì)粒組細胞相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 miR-203a-3p與Fstl 1靶向調(diào)控關(guān)系與mimic NC組比較：*P<0.05

3 討論

ALI是一種復(fù)雜的臨床并發(fā)癥，常常伴有炎癥反應(yīng)，微血管損傷以及肺血管和上皮細胞通透性增加，甚至可能發(fā)展為更嚴重的致命性急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI具有較高的發(fā)病率和死亡率，目前尚無特效的治療方法，不僅增加社會經(jīng)濟負擔(dān)，還嚴重降低患者生活質(zhì)量。眾所周知，過度炎癥反應(yīng)是誘發(fā)ALI的重要因素，有效控制過度炎癥反應(yīng)是治療ALI的常用方案。LPS 是內(nèi)毒素的主要成分，進入機體后可快速誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致彌漫性肺損傷，腹腔注射LPS是目前制備ALI動物模型常用的理想方法[11]。研究[12]表明，肺纖維化是ALI的關(guān)鍵病理過程，其病理特征是肺上皮細胞損傷、成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)沉淀。本研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)LPS誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的肺損傷及肺纖維化現(xiàn)象，且BALF中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，肺組織W/D值及Hyp含量明顯增加，提示本研究ALI后肺纖維化模型制備成功。

miRNA在ALI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，吳松林 等[13]在研究中證實，miR-125b可能通過調(diào)控Notch1蛋白的表達影響膿毒癥急性肺損傷中炎癥因子的表達，參與其免疫炎癥調(diào)控過程；Wang et al[14]發(fā)現(xiàn)miR-19能夠減輕LPS誘導(dǎo)所致ALI的炎癥反應(yīng)。同時，也有研究[5]顯示，在高原缺氧所致肺損傷模型中miR-203a-3p表達下調(diào)，并與肺微血管形成介導(dǎo)的肺水腫有關(guān)。Ling et al[6]研究顯示，在膿毒性休克小鼠模型中 miR-203低表達，其過表達可通過靶向下調(diào)VNN1，激活A(yù)KT信號通路，從而減輕膿毒性休克肺損傷。以上提示miR-203a-3p在肺損傷過程中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，ALI組大鼠肺組織中miR-203a-3p表達水平明顯降低。為了探討miR-203a-3p在ALI過程中的作用及其對ALI后肺纖維化的影響，本研究通過尾靜脈注射miR-203a-3p agomir上調(diào)ALI大鼠肺組織中miR-203a-3p表達，進一步研究結(jié)果顯示，miR-203a-3p過表達后agomir組大鼠肺損傷及纖維化程度得到明顯改善，肺組織W/D值及Hyp含量顯著降低，同時BALF中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低，表明miR-203a-3p過表達可顯著改善ALI大鼠肺損傷及肺纖維化。

Fstl1是一種由308個氨基酸組成的分泌型糖蛋白，定位于3q13染色體上，在心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用。楊華 等[15]研究顯示，F(xiàn)stl1可以通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad2/3信號通路來調(diào)控成纖維細胞活化及細胞外基質(zhì)合成，具有促纖維化作用。本研究結(jié)果顯示，ALI組大鼠肺組織中Fstl1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高；進一步通過Targetscan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-203-3p 與Fstl1 3′UTR 存在互補序列；隨后通過雙熒光素酶實驗報告證實，F(xiàn)stl1是miR-203a-3p靶基因。因此，miR-203a-3p過表達可能通過靶向下調(diào)Fstl1表達改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷后肺纖維化，但還需要進一步研究證實。

綜上所述，本研究初步探明miR-203a-3p在ALI大鼠肺組織中低表達，其過表達可降低ALI大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，改善ALI大鼠肺損傷及肺纖維化，其機制可能與靶向下調(diào) Fstl1表達有關(guān)。因此，miR-203a-3p可能成為ALI后肺纖維化治療的潛在靶點，但還需要更多的實驗進行論證。