蟲草素對老年大鼠心臟功能的保護作用及其機制

何佛容，陳 馳，潘媛媛，鄧勝男，施 勇，陶雪飛

衰老是心血管疾病的危險因素之一[1]。心臟衰老的主要特征是舒張功能障礙、收縮力下降、脂質積聚、氧化應激、成纖維細胞的分泌異常、自噬減少和蛋白激酶途徑信號的改變[2]。此外，衰老引起心房、心室、心肌等結構改變，導致心臟傳導系統、血管系統的功能障礙[3]，嚴重威脅人們的健康。隨著世界老年人口的增加，尋找緩解心臟老化、保護心臟功能的方法具有重要意義。

蟲草素(cordycepin, Cor)是德國科學家Cunningham et al[4]從蛹蟲草中提取的核苷類抗生素，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、抗癌等廣泛藥理活性[5]。Cor在營養保健和臨床治療方面具有巨大的潛力及研究價值。其中，Cor通過激活Akt/GSK-3β/p70S6K信號通路和HO-1表達，緩解大鼠心臟缺血/再灌注損傷[6]，但未見Cor在心臟衰老方面的報道。該研究探討Cor對老年大鼠心臟功能的保護作用及其機制，以期為臨床治療提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只雄性SPF級SD大鼠，其中10只3月齡大鼠作為青年對照組，體質量(280±35.3) g，40只20 ～ 22月齡大鼠作為老年組，體質量(685±52.6) g，適應性飼養1周后，隨機分組。所有大鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2016-0011。動物實驗遵循3R原則，給予動物人道關懷。

1.2 藥物與試劑Cor購自上海源葉生物(貨號B20196)；肌鈣蛋白I(cardiac troponin Ⅰ，cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)、肌紅蛋白(myohemoglobin，Mb)試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司(貨號：JLC6968、JLC662、JLC6960)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(貨號：ml076328、ml077384、ml076593)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：T2190)；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cleaved cysteine aspartic protease 9，cleaved Caspase 9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartic protease 9，Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic protease 3，Caspase-3)等相關抗體購自上海艾博抗貿易有限公司；核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)、醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)等相關抗體以及辣根過氧化物酶標記的二抗購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；RIPA裂解液購自北京普利萊基因技術有限公司(貨號：C1053-500、)；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自上海炎熙生物科技有限公司(貨號：PD-BCA-500)；4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、蘇木精-伊紅溶液購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(貨號：C104190、X139941、E111994、E196384)。

1.3 主要儀器SA703小動物霧化給藥儀購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；MR-96T酶標儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；EG1150石蠟包埋機購自德國萊卡Leica公司；S700A旋轉式石蠟切片機購自深圳瑞沃德生命技術有限公司；ZX-S24恒溫水浴鍋購自上海知信實驗儀器技術有限公司；XSP-8CA顯微鏡購自上海光學儀器廠；P6-VET實驗動物超聲診斷儀購自江蘇大為醫療有限公司。

1.4 方法

1.4.1動物分組與造模 參考文獻[7]，適應性飼養1周后，將10只青年大鼠作為青年對照組；將40只老年大鼠隨機均分成4組，分別為老年模型組、Cor低劑量組、Cor中劑量組、Cor高劑量組。各給藥組分別灌胃 5、10、20 mg/kg Cor，老年組與青年組灌胃等量的生理鹽水，1次/d，共4周。各組大鼠室溫飼養，正常自由飲水進食。末次給藥后麻醉，進行超聲心動圖檢測，腹主動脈取血后處死，解剖取心臟，冷的生理鹽水清洗后，取部分用4%多聚甲醛固定，剩余組織制備勻漿待用。

1.4.2超聲心動圖檢測大鼠心臟功能 各組大鼠吸入異氟烷霧化氣體麻醉后，對左前胸區域脫毛處理，仰臥位固定于加熱板上，設置溫度為37 ℃，腹部朝上，稍微向左傾斜，實時監測心電圖，并進行超聲檢查。大鼠胸部涂耦合劑，將超聲診斷儀的探頭放置在心臟胸骨左緣并移至乳頭肌水平，分別運用二維B型超聲及M型超聲，顯示并記錄左室短軸切面及左心室運動曲線，獲得大鼠的心率(heart rate，HR)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、短軸收縮率(fractional shortening，FS)指標數據。

1.4.3ELISA法檢測血清中心臟功能損傷標志物水平和氧化應激標志物水平 取血后，離心收集上清液。按照cTnI、CK-MB、Mb、SOD、MDA、LDH試劑盒說明書進行操作。將樣品放入反應孔孵育45 min后洗滌。加入生物素標記的抗體反應30 min，顯色劑15 min。加入終止液，采用酶標儀進行檢測。

1.4.4HE染色觀察心臟組織病理形態 取出固定的組織，修剪后進行脫水透明處理，用梯度乙醇從低濃度到高濃度浸洗，隨后浸入二甲苯中，10 min后浸入蠟中。采用石蠟包埋機對浸蠟后的標本做進一步包埋，冷卻1 h后進行切片，并平鋪于35～38 ℃的水面上，使蠟片自然展平，取出蠟片置于載玻片上，用濾紙吸收多余的水分，移至恒溫箱中烘烤15～20 min進行脫蠟處理，最后使用蘇木精-伊紅溶液進行染色，使用顯微鏡觀察并拍照分析。

1.4.5TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡情況 制作石蠟切片后進行脫蠟、水合、透明處理，在標本上分別加入TUNEL反應混合液，加入蓋玻片反應1 h, 隨后用PBS溶液漂洗3次，加入DAB底物反應10 min后漂洗3次。用顯微鏡觀察凋亡細胞形態。

1.4.6Western blot檢測心肌細胞中凋亡相關蛋白的表達 取制備的心臟組織勻漿液，加入RIPA裂解液，冰浴、離心后用BCA試劑盒測定蛋白濃度，煮沸變性后獲取上樣樣本，經SDS-PAGE分離、轉膜、封閉后，采用cleaved Caspase 9、cleaved Caspase 3、Caspase 3、Nrf2、NQO1、HO-1等相關一抗進行孵育，4 ℃過夜，TBST溶液洗滌3次后采用相關二抗進行孵育，1.5 h后加入發光液，顯色處理，并統計灰度值，計算相應蛋白表達量，實驗重復3次。

2 結果

2.1 Cor對老年大鼠心臟功能的影響與青年對照組相比，老年模型組HR、LVEF、FS的水平降低(P<0.05)，與老年模型組相比，Cor中、高劑量組HR、LVEF、FS的水平升高(P<0.05)，見表1。提示Cor能夠緩解心臟功能指標的降低，在一定程度上改善心臟收縮、舒張功能。

表1 Cor對老年大鼠心臟功能的影響

2.2 Cor對老年大鼠心臟功能損傷標志物水平的影響cTnI、CK-MB、Mb是心臟功能損傷標志物。與青年對照組相比，老年模型組CK-Mb、Mb、cTnI 的水平升高(P<0.05)，與老年模型組相比，Cor中、高劑量組CK-Mb、Mb、cTnI 的水平降低(P<0.05)，見表2。提示Cor能夠降低心臟功能損傷標志物水平。

表2 Cor對老年大鼠心臟功能損傷標志物水平的影響

2.3 Cor對老年大鼠心臟組織病理學的影響青年對照組大鼠心肌細胞排列整齊，結構清晰，細胞無腫脹、變性壞死；老年模型組心肌細胞排列疏松紊亂，有空泡樣變性，部分心肌溶解壞死，肌纖維肥大斷裂；Cor各給藥組與老年模型組相比，細胞排列紊亂、腫脹、壞死，肌纖維自溶、斷裂的現象減輕，見圖1。提示Cor能夠緩解組織結構的紊亂和病變，改善心肌細胞損傷。

圖1 Cor對老年大鼠心臟組織病理學的影響 ×400A:青年對照組；B：老年模型組；C：Cor低劑量組；D：Cor中劑量組；E：Cor高劑量組

2.4 Cor對老年大鼠心臟組織氧化應激指標的影響與青年對照組相比，老年模型組MDA、LDH 的含量升高，SOD的活性降低(P<0.05)；與老年模型組相比，除Cor低劑量組差異無統計學意義外，Cor中、高劑量組MDA、LDH 的含量降低，SOD的活性升高(P<0.05)，見表3。提示Cor能夠緩解心臟組織氧化應激反應。

表3 Cor對老年大鼠心臟組織氧化應激指標的影響

2.5 Cor對老年大鼠心肌細胞凋亡的影響青年對照組正常心肌細胞核呈淡藍色；老年模型組心肌細胞核偏褐色，染色質積聚成致密的團塊，胞質有部分黃染，提示有大量凋亡細胞；與老年模型組相比，Cor各給藥組細胞凋亡減少，見圖2。提示Cor緩解老年大鼠心肌細胞的凋亡。

圖2 Cor對老年大鼠心肌細胞凋亡的影響 ×200A:青年對照組；B：老年模型組；C：Cor低劑量組；D：Cor中劑量組；E：Cor高劑量組

2.6 Cor對老年大鼠心肌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響與青年對照組相比，老年模型組cleaved Caspase 9/Caspase9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表達升高(P<0.05)；與老年模型組相比，除Cor低劑量組差異無統計學意義外，Cor中、高劑量組cleaved Caspase 9/Caspase 9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表達降低(P<0.05)，見圖3。提示Cor能夠抑制老年大鼠心肌細胞凋亡，緩解心臟功能損傷，與2.5項結果一致。

圖3 Cor對老年大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響A：青年對照組；B：老年模型組；C：Cor低劑量組；D：Cor中劑量組；E：Cor高劑量組；與青年對照組比較：*P<0.05；與老年模型組比較：#P<0.05

2.7 Cor對老年大鼠心肌細胞中Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達的影響與青年對照組相比，老年模型組p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表達降低(P<0.05)；與老年模型組相比，Cor中、高劑量組p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表達升高(P<0.05)，見圖4。提示Cor對老年大鼠心臟功能具有保護作用，其機制可能與促進Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達有關。

圖4 Cor對老年大鼠心肌細胞Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達的影響A：青年對照組；B：老年模型組；C：Cor低劑量組；D：Cor中劑量組；E：Cor高劑量組；與青年對照組比較：*P<0.05；與老年模型組比較：#P<0.05

3 討論

Cor在治療人類疾病中具有良好的藥用潛力。其中，Cao et al[8]的研究顯示，Cor通過體內外自噬誘導對糖尿病腎病有良好的治療效果；Han et al[9]的報道表明，Cor通過調節炎癥、凋亡和氧化應激作用緩解腎臟缺血損傷；Wang et al[10]的研究指出，Cor通過激活AMPKα通路改善心肌肥厚程度。本研究結果顯示，Cor干預治療后HR、LVEF、FS的水平升高；細胞排列紊亂、腫脹、壞死，肌纖維自溶、斷裂的現象減輕； CK-Mb、Mb、cTnI 的水平降低。實驗提示，Cor能夠緩解心臟功能指標的降低，在一定程度上改善心臟收縮、舒張功能；能夠降低心臟功能損傷標記物水平；能夠緩解組織結構的紊亂和病變，改善心肌細胞損傷。

細胞氧化應激會引起蛋白質損傷、脂質紊亂、DNA突變等有害的生化反應。其中，SOD在保護細胞免受氧自由基的毒害中發揮著重要作用，但隨著年齡的增長，體內SOD的含量呈下降趨勢，增長的自由基會破壞機體的平衡，使機體產生各種疾病[11]。MDA是脂質過氧化的產物，其含量反映組織過氧化的程度[12]。LDH主要存在于胞質內，不能通過細胞膜，當細胞受損或凋亡時才被釋放，因此，LDH水平與細胞凋亡程度成正相關。本研究結果顯示，Cor干預治療后MDA、LDH 的含量降低，SOD的活性升高，提示Cor能夠緩解心臟組織氧化應激反應。

細胞凋亡具有調控細胞衰老和程序性死亡的效應，可及時清除機體內多余和受損傷的細胞，維持組織器官的穩定性。細胞凋亡主要由Caspase蛋白酶家族所調控，當細胞接收到刺激信息，促進凋亡小體的生成，通過自我剪切方式活化Caspase 9，Caspase 9進一步對下游Caspase 3進行活化。活化的Caspase 3可促使相關蛋白表達，cleaved Caspase 3進一步破壞細胞骨架及管家基因的功能，影響正常細胞信號的傳遞、周期的調控，使細胞出現核凝結、核裂解等凋亡形態學上的改變。本研究結果顯示，Cor干預治療后cleaved Caspase 9/Caspase 9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表達降低，提示Cor能夠抑制老年大鼠心肌細胞凋亡，緩解心臟功能損傷。

Nrf2是一種抗氧化轉錄因子，當機體受到不利刺激時，啟動下游HO-1、NQO1及SOD等抗氧化基因的轉錄。HO-1在體內具有抗氧化、細胞保護作用，可清除氧自由基，阻止脂質過氧化。Cor通過Nrf2/HO-1途徑緩解脂多糖誘導的急性肺損傷[13]；通過Nrf2和AMPK抑制細胞衰老，進而達到預防輻射潰瘍的作用[14]；通過Nrf2/HO-1/NF-κB通路發揮抗肝癌的作用[15]。本研究結果顯示，Cor干預治療后p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表達升高，提示Cor對老年大鼠心臟功能具有保護作用，其機制可能與促進Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達有關。

綜上所述，Cor能夠改善老年大鼠心臟功能，緩解氧化應激反應，抑制心肌細胞凋亡，對大鼠心臟組織損傷具有一定的保護作用，其機制可能與促進Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達有關。