白楊素聯合氯喹抑制卵巢癌細胞增殖促進凋亡的研究

史于傳，何 宇，楊 陽，范懿雋，楊 芳，詹 磊，衛 兵

卵巢癌是威脅女性生命的惡性腫瘤之一[1]。其發病率位于婦科腫瘤第三[2]。臨床上，其標準的治療方法為手術治療聯合化療[3]。但是卵巢癌對化療固有的耐藥性導致其預后不良[4-5]。因此，有必要探索新的治療方法。在自然界中，存在一類具有生物活性的類黃酮物質，白楊素(5，7-二羥基黃酮)就是其中一種[6]。研究[7]表明，白楊素具有抗腫瘤活性，能夠通過誘導細胞凋亡和細胞周期停滯抑制腫瘤生長。自噬是細胞一種代謝過程，通過分解、回收再利用，維持細胞內的穩態。先前的一些研究[8]中報道了白楊素可以促進自噬，從而對腫瘤細胞進行調控。該研究旨在探索白楊素是否通過調控自噬在卵巢癌細胞中發揮作用，以期獲得新的有效治療方法。

1 材料與方法

1.1 細胞系SKOV3卵巢癌細胞系購自Sigma公司，保存于安徽醫科大學第二附屬醫院中心實驗室的液氮罐中。用McCoy′s 5A (上海元培生物科技有限公司)培養基進行復蘇和培養，培養基包含了10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素。培養于含有5%CO2的37 ℃的溫箱環境，每天早晚各觀察1次細胞狀態，2～3 d進行1次細胞換液，待細胞生長至80%左右，進行后續的實驗。使用DMSO對白楊素(純度≥99.8%，貨號:HY-14589，美國MCE公司)進行稀釋，用終濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L的白楊素處理SKOV3細胞24 h。氯喹(chloroquine，CQ)購自美國MCE公司，使用DMSO進行配置，終濃度為60 μmol/L，聯合處理時，先用CQ對細胞進行1 h的預處理，再用白楊素處理24 h。

1.2 標本收集選取于安徽醫科大學第二附屬醫院婦產科行卵巢癌手術切除的卵巢組織標本，所有卵巢癌患者術前均未進行化療等其他治療且病史詳細，病理類型為漿液性卵巢癌。手術病理分期為I期。同時選取行雙側附件切除患者(絕經后子宮肌瘤行雙側附件切除)的卵巢組織，經病理診斷為正常卵巢組織。卵巢癌組年齡為51～61(56.16±5.37)歲，正常卵巢組織年齡為50～59(54.52±4.62)歲，差異無統計學意義。兩組各20例患者，均為絕經后女性，且均無高血壓、糖尿病等慢性疾病。兩組均選取卵巢皮質進行實驗。標本均獲得患者知情同意，符合倫理標準(倫理編號：LLSC20180085)。

1.3 免疫組化將組織石蠟切片脫蠟，置于檸檬酸鈉緩沖液(含0.05%吐溫20，pH 6.0)中，在高壓鍋中煮沸15 min。使用配置的3%過氧化氫-甲醇混合物，對內源性過氧化作用進行阻斷。正常山羊血清完全覆蓋切片，在室溫下進行1 h的封閉。在初級抗體(LC3 1 ∶100)中孵育8 h，孵育環境為4 ℃濕盒。在次級抗體中孵育30 min，此步驟在室溫下進行。DAB顯色，蘇木精對細胞核復染。梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明。最后中性樹膠固定。

1.4 Western blot檢測蛋白表達向SKOV3細胞中加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液對細胞進行裂解。通過離心收集的裂解物，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結束后，使用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(上海Biosharp公司)進行轉膜處理。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h。用TBST洗滌3次，將膜與特異性一級抗體在4 ℃孵育過夜。次日將膜與次級抗體在37 ℃孵育2 h。使用ECL化學發光試劑盒觀察蛋白質條帶。主要抗體GAPDH (AB8245)、LC3B (EPR18709)購自美國Abcam公司。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖在96孔板上，對處理完成后的SKOV3細胞進行接種。向每個孔中加入10 μl的CCK-8溶液，將細胞在37 ℃孵育2 h，然后測量混合物在450 nm處的吸光度，以測試細胞增殖情況。

1.6 透射電子顯微鏡觀察細胞形態及自噬小體數目SKOV3細胞用不同濃度的白楊素處理并在37 ℃孵育24 h后，收集細胞并用PBS洗滌2次，離心、收集。用2.5%戊二醛固定至少2 h。將細胞團在2%四氧化鋨中固定2 h，在不同濃度的乙醇中脫水(每15 min一次，20%、40%、60%、70%、80%、90%和100%)。然后將小球包埋在楤木中，用超微粉碎機以70 nm的厚度切片。超薄切片用2%醋酸鈾酰和0.2%檸檬酸鉛染色。電子顯微鏡下觀察細胞形態及自噬小體數目。

1.7 免疫熒光檢測將SKOV3細胞接種到載玻片上12 h。使用白楊素處理24 h后，用PBS洗滌細胞3次，并在4%多聚甲醛中固定15 min。載玻片中的非特異性結合位點用5%牛血清白蛋白(BSA)阻斷30 min。使用LC3(1 ∶200)孵育過夜。用熒光標記的二抗孵育細胞，4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)在黑暗中對細胞核進行染色。用蔡司熒光顯微鏡對樣品進行成像處理。

1.8 細胞凋亡檢測根據標準技術對各組的凋亡細胞百分比進行量化。將處理過的細胞用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化后收集，100 μl的結合緩沖液進行再懸浮處理，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，黑暗環境中孵育15 min。采用Beckman Coulter公司(美國)的Navios流式細胞儀進行流式細胞檢測，凋亡細胞圖像使用FlowJo分析。點圖上的右下象限和右上象限分別代表早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞。

2 結果

2.1 卵巢組織與卵巢癌組織中LC3的表達免疫組化結果顯示，與正常卵巢組織相比，LC3在卵巢癌中具有較高的表達量，見圖1。正常卵巢組織LC3表達(1.00±0.08)低于卵巢癌組(2.13±0.11)(P<0.01)。

圖1 免疫組化檢測組織LC3表達 ×200

2.2 白楊素抑制SKOV3細胞的增殖分別用0、20、40、60、80、100 μmol/L白楊素對SKOV3細胞進行處理，時間為24 h。檢測細胞增殖情況，CCK-8結果提示隨著濃度增加，細胞增殖降低，見圖2。40 μmol/L白楊素抑制SKOV3細胞的增殖，因此，本研究后續實驗選取40 μmol/L白楊素進行實驗。

圖2 白楊素對細胞增殖影響

2.3 白楊素誘導SKOV3細胞自噬的形成白楊素處理細胞系(SKOV3)24 h后，Western blot 結果提示，與對照組相比，白楊素上調了LC3蛋白的表達(t=25.86，P<0.05)，見圖3。免疫熒光提示白楊素誘導LC3表達上升，見圖4。通過透射電鏡可以觀察到，與對照組比較，白楊素處理24 h的SKOV3細胞出現較多的自噬小體，在對照組則未觀察到自噬小體的存在，見圖5。另外，當白楊素與CQ聯合使用24 h后，聯合處理組的LC3蛋白表達量高于白楊素和CQ單獨處理組(t=7.54、41.79，P<0.05、0.01)，見圖6。

圖3 白楊素處理后LC3蛋白的表達與對照組比較：*P<0.05

圖4 免疫熒光檢測LC3的表達 ×400

圖5 SKOV3細胞超微結構箭頭：自噬小體

圖6 LC3蛋白的表達與白楊素組比較：#P<0.05；與CQ組比較：**P<0.01

2.4 白楊素抑制SKOV3細胞的增殖和促進細胞凋亡白楊素與CQ聯合使用24 h后，聯合處理組的細胞增殖低于白楊素和CQ單獨處理組(F=47.48，P<0.05)，見圖7。對流式細胞儀的結果進行分析，白楊素處理SKOV3細胞后，凋亡的細胞增加，CQ組細胞凋亡比例也高于對照組。白楊素+CQ組細胞凋亡比例最高(F=128，P<0.01)，見圖8。

圖7 SKOV3細胞增殖與白楊素組比較:*P<0.05

圖8 白楊素對SKOV3細胞凋亡影響

3 討論

卵巢癌是一個“沉默的婦女殺手”，由于其發現時間晚，同時缺乏有效的治療方法，死亡率一直居高不下[2]。因此，迫切需要尋求新的治療方案。白楊素是一種具有生物活性的類黃酮物質，對多種腫瘤存在抑制作用，在本實驗中，白楊素能夠降低卵巢癌細胞的增殖能力，促進卵巢癌細胞的凋亡，這說明白楊素具有卵巢癌細胞殺傷作用。然而具體的機制尚不明確。

自噬作為一種細胞調控機制，通過降解和回收受損細胞器、畸形蛋白或局部細胞質來維持細胞內穩態，這是一個高度動態的多步驟生物學過程。先前的研究[9-10]表明，自噬水平的變化能夠影響卵巢癌細胞的增殖、遷移等特征。

本實驗顯示經由白楊素處理后，SKOV3細胞的自噬水平有所升高。主要表現在LC3蛋白水平的升高和電鏡下可以觀察到的自噬小體數目的增加。LC3作為自噬小體上一個重要的標志蛋白，其表達量的增加從側面也可反映自噬小體數目的增加。同時，細胞中自噬小體數目的增加又可以歸結于兩種原因：一種是自噬流的增加，表現為自噬小體合成的增加；另一種是自噬小體分解被抑制，細胞內的自噬小體通過累積而增多。作為自噬的抑制劑，CQ的主要作用是抑制自噬小體和溶酶體的融合，從而抑制自噬小體的降解。本實驗表明白楊素聯合CQ使用后LC3的表達水平較單獨白楊素處理組升高。這表明白楊素可使自噬流增加，而不是抑制自噬小體的分解。

自噬是一把雙刃劍，自噬的增加一方面可以促進腫瘤細胞的凋亡。另一方面，具有保護作用的自噬也能協助腫瘤細胞對不良外界環境產生一定的抵抗[11]。為了明確白楊素誘導自噬所發揮的作用，課題組使用CQ來抑制自噬，結果顯示當自噬被抑制后，卵巢癌細胞的凋亡增多，這說明白楊素誘導的自噬是具有保護作用的。當這種具有保護作用的自噬被抑制后，細胞的凋亡能夠進一步的上升，其可能的原因為白楊素殺傷腫瘤細胞時，癌細胞通過增加自噬來為自身生長提供所需的營養，一定程度上抵消藥物的殺傷作用，當CQ抑制了這種自噬，細胞失去了這種保護作用，導致白楊素的藥效增強。