核殼型納米Au@Ag復合材料的制備、催化及光抑菌*

劉智峰,房 迅,郭少波,湯 波,季曉暉

(1. 陜西理工大學 化學與環境科學學院，陜西 漢中 723001；2.陜西省催化基礎與應用重點實驗室，陜西 漢中 723001；3. 秦巴生物資源與生態環境國家重點實驗室，陜西 漢中 723001)

0 引 言

貴金屬金(Au)、銀(Ag)納米顆粒具有豐富的表面等離子共振、強消光系數、高生物相容性和化學穩定性等優點被廣泛應用于生物醫藥、生物影像、醫用材料、催化等領域[1-3]。納米Au、Ag顆粒吸收近紅外光譜后表面電子產生共振而具備局域熱效應，且局域電子躍遷，易與介質溶液結合生成強氧化物或超氧化物(ROS)而具備殺菌活性，Au、Ag抑菌性能也與釋放的Au+、Ag+粒子有關[4-6]，細菌粒子通道中的銅離子通道蛋白可主動運輸Au+和Ag+(Cu+作為細菌的微量元素，且Au+和Ag+的d電子軌道與其相似)，Au+、Ag+粒子進入細菌內部，和氨基酸中的-SH配位生成螯合物，不可逆的破壞功能蛋白的空間結構或改變新陳代謝所需的液質環境致使細菌死亡；其次，微量的Au、Ag進入細菌內部與細胞質反應生成活性氧簇(ROS)，活性氧簇可直接作用細胞器對細菌造成根本性破壞且不產生耐藥性[7-9]。但由于納米Au顆粒第一電離能較高，在介質中釋放的Au+較少，因此抑菌活性較低，而Ag的抑菌性能與比表面積有關，比表面積越大抑菌性能越強，但比表面積越大表面能越高，Ag越易團聚而降低其抑菌活性，且納米Ag在空氣中易氧化等缺點限制Au、Ag的應用。為充分利用Au、Ag的相關性能，目前解決方案之一[10-11]是利用納米Au的可塑性把Ag負載在其表面合成核殼型Au@Ag復合材料，其結果表明，核殼型Au@Ag吸收近紅外譜后，Au核表面的電子發生共振，Ag接受電子在其表面形成負環境可增強Ag的穩定性，Au@Ag吸收可見光后局域熱效應誘導周圍環境溫度升高，此作用可為癌細胞的滅活和增強對細菌的抑制提供新思路，且核殼型Au@Ag可增大Ag的比表面積，防止Ag團聚。

Au、Ag顆粒的催化加氫性能與自身電子結構相關，其表面的電子具有缺陷位，容易與氧原子形成共價鍵、利于形成“活性中間體”或“過渡中間態”而具備催化性能，但催化活性與電子d軌道的排布有關，Pd為重要的催化劑其d軌道具有9電子，易于吸附和脫附氫原子而具有較強的催化性能，但其價格昂貴，成本較高不利于大規模應用[12]。有學者報道[13]，將Pd與Au、Ag貴金屬復合成合金，可有效降低其電子密度，提高對氫原子的吸附和脫附性能而增益其催化活性。理論上將Ag、Au復合不僅可提高其催化性能，且利用其吸收近紅外光譜提高局域溫度增強其抑菌性能，而對此類雙重性能的研究未曾報道。為此，本研究以Au為核，在其表面負載Ag合成核殼型納米Au@Ag復合材料，以甲基橙為模型污染物研究其催化加氫活性，用革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(S.aureus)為模型菌研究材料的光動力抑菌性能，并探討其抑菌機制。

1 實 驗

1.1 試劑和儀器

一縮二乙二醇、硫氫化鈉(NaHS)、三氟醋酸銀(CF3COOAg)、鹽酸(HCl)等均為市售分析純購自于天津市大茂化學試劑廠；聚乙烯吡咯烷酮 K30(PVP)、丙酮、檸檬酸鈉、抗壞血酸和甲基橙購自于天津市致遠化學試劑有限公司；AgNO3、NaOH和NaBH4購自于廣州市鑫鉑化工有限公司；HAuCl4購自上海吉至生化科技有限公司；酵母浸粉、胰蛋白胨和瓊脂購自上海展云化工有限公司。E.coli和S.aureus均由陜西省食用菌研究所提供。

FEI Tecnai G2 F20型透射電子顯微鏡(TEM，荷蘭FEI公司)；紫外-可見漫反射吸收光譜(Cray 100)；YXQ-50G干燥型立式蒸汽高壓消毒鍋(浙江，中友公司)；ZGZ-150A型智能光照培養箱(上海丙林電子科技有限公司)； C80混合反應微量熱儀(法國塞塔拉姆(Setaram)公司)；奧林巴斯倒置顯微鏡CKX41。

1.2 納米Ag顆粒的制備：

取100 mL的一縮二乙二醇加入到250 mL燒瓶中150 ℃加熱30 min，再加入1.2 mL 3 mmoL NaHS，攪拌10 min，繼續滴入10 mL 3 mmoL HCl與25 mL 20 mg/mL 的PVP(以上溶劑均為一縮二乙二醇)，加熱至150 ℃攪拌10 min，最后滴加8 mL 282 mmoL CF3COOAg 150 ℃反應30 min得到納米Ag溶膠，冰水浴中冷卻終止反應[14]，用丙酮在離心機15000 r/min下洗滌3次，0.5%檸檬酸鈉洗滌2次，真空干燥箱中烘干備用。

1.3 納米Au@Ag的制備：

1.3.1 納米Au顆粒的制備:

將2 mL 25 mmoL/L的HAuCl4滴加在100 mL超純水中煮沸20 min，其次加入10 mL 75 mmol/L的檸檬酸鈉，100 ℃反應25 min得到納米Au溶膠[15]，在2 ℃冰箱中冷藏2 h備用。

1.3.2 納米Au@Ag顆粒的制備:

取上述納米Au溶膠50 mL，分別加入300 μL的抗壞血酸(0.1 moL/L)，75 μL的AgNO3和375 μL的NaOH反應30 min，在離心機12 000 r/min下蒸餾水洗滌3次，0.5%檸檬酸鈉洗滌2次烘干備用。

1.4 納米Au@Ag顆粒的催化實驗：

因為甲基橙在紫外可見光處有特征吸收峰，且吸收峰的強弱和濃度呈正比，因此，本實驗以甲基橙為目標污染物，用NaBH4還原甲基橙監測納米Au@Ag顆粒的催化活性。取甲基橙濃度0.25 mmol/L的溶液1 mL和2 mL 0.02 mol/L NaBH4加入比色皿中，最后加入0.5 mg/mL催化劑0.2 mL，在波長范圍為200 nm～800 nm 下，間隔2 min監測465 nm處吸光度的變化[16]，按照以下公式計算降解率R。

式中：R為降解率；C0為初始濃度；C為殘留濃度。

1.5 納米Au@Ag顆粒的抑菌實驗：

1.5.1 濾紙片擴散實驗

將生物材料放置于120 ℃高壓滅菌鍋20 min作殺菌處理，用無菌的納米Au、Ag和Au@Ag顆粒分散在滅過菌的超純水中，制備成濃度為100，200，300和400 μg/mL的梯度的溶液。將隔夜活化好的細菌用無菌超純水稀釋成5×107CFU (colony-forming units)/mL，取20 μL均勻涂在滅過菌的固體LB培養基上，取8 μL沾有不同材料的抑菌液放置在接過菌的LB培養基上分別在在黑暗和光照下培養12 h平行做6組觀察結果[17]

1.5.2 菌落計數法實驗

將納米材料加入到5×105CFU/mL菌懸液中，最終Au@Ag質量濃度為300 μg/mL，分別在300 W的日光燈在照射5 、10、20和40 min，8 000 r/min 離心取上層液10 μL均勻涂在滅過菌的固體LB培養基上，平行做6組，正常培養12 h后觀察結果[18]，抑菌效率(n)為

式中：n代表抑菌效率，B0為參照中菌落個數，B是含有不同材料的抑菌結果菌落數。

1.5.3 細菌生長曲線監測法實驗

將材料和接過菌的液體LB培養基混合配成5 mL溶液， 最終細菌濃度為5×107CFU，材料濃度為300 μg/mL，日光燈下照射10 min后加入微量熱分析儀中，37 ℃下監測細菌的生長和熱量釋放強度。

1.5.4 細菌PI染色法實驗

將上述混合液在日光燈下照射10 min，加入50 μg/mL的碘化丙啶(PI) 50 μL黑暗環境下混合15 min，在13 000 r/min的離心機下，用磷酸緩沖液洗滌3次，在熒光倒置顯微鏡下觀察細菌的損傷情況[19]。

2 實驗結果與討論

2.1 復合材料TEM表征

納米Au@Ag復合材料的形貌測試結果如圖1所示。由圖1(a，b)可知，制備的納米Au@Ag復合材料為單分散核殼球型結構，內球Au的粒徑為(10±5)nm，外球Ag厚度為(5±3)nm，而圖1(c，d)納米Ag粒子為單分散顆粒狀，粒徑為(15±3)nm，粒徑分布較均勻，形貌不規則，其主要原因是納米Ag顆粒在空氣中不穩定(E(Ag+/Ag)=0.80 V)，導致其形貌不規則，相比納米Ag粒子，納米Au@Ag理論上更加穩定，其原因是納米Ag的標準還原電勢小于Au，納米Au與Ag復合，Ag電子流向Au而增強Au的穩定性，且在近紅外光照射下，納米Au中的電子躍遷至納米Ag表面，致使納米Ag表面形成負環境而降低復合材料的電子云密度[20]，因此制備的納米Au@Ag材料更加穩定。為進一步證明其合成材料為核殼結構，對復合材料進行了EDX能譜分析和EDX面掃描元素分布(mapping)表征。圖2為制備的Au@Ag復合材料對應mapping圖譜.由圖2可知，材料含有Au、Ag兩種元素，其中Ag元素為殼，為內空球型結構，元素Au為球核，證明合成的Au@Ag為核殼球型結構，這與TEM的結果一致。

圖2 Ag@Ag樣品的元素的面分布圖像Fig 2 EDX spectrum images of Ag@Ag samples

2.2 復合材料UV-Vis表征

圖3為樣品的UV-Vis吸收光譜，圖中制備的納米Au和Ag在525 和400 nm處有明顯吸收峰，分別對應單質Au和Ag的特征吸收峰[21]，而納米Au@Ag在525和400 nm處均出現吸收峰，證明制備的材料中同時具有單質Au和Ag。圖中未出現其他雜峰，證明合成的材料純度較高，結合TEM結果證明制備的Au@Ag均以單質形態存在。

圖3 樣品Au，Ag和Au@Ag的紫外-可見吸收光譜Fig 3 UV-Vis absorption spectra of Au, Ag and Au@Ag samples

2.3 復合材料催化活性

圖4為Au、Ag和Au@Ag對甲基橙的催化加氫降解測試結果。圖4a中甲基橙的峰面積(或吸光度)隨著催化時間的增加而降低，此為Au對甲基橙的降解過程，在20 min內催化降解率(以初始濃度為參比)為41.25%，圖4b為納米Ag的催化降解過程，在20 min內降解率為45.12%，而圖4c中納米Au@Ag在8 min內對甲基橙的降解率為99.58%。通過對比可知，納米Au@Ag的催化活性明顯強于單獨的納米Au、Ag，其主要原因是單獨使用納米Au、Ag時在介質中易團聚而降低了其催化性能，以納米Au為核，把Ag負載在其表面可明顯提高其催化活性，增加其穩定性。此外，在249 nm處出現的新峰面積隨甲基橙的峰面積降低而增加，此為材料對甲基橙的降解產物對氨基苯磺酸鈉，為驗證其產物，用商品對氨基苯磺酸鈉進行紫外可見分析，其結果圖4d和降解產物一致。其可能的催化機制為[22,16]：Au與Ag的d電子軌道為半充滿狀態，d軌道可接受NaBH4中的H-粒子形成過渡態產物Au-H或Ag-H，過渡態產物可與甲基橙中的N=N加成形成-NH2釋放出納米Au或Ag，而具備催化加氫活性(其機理為圖5所示)，但Au與Ag的催化活性和比表面積成正比，比表面越大，活性位點越多，電子轉移速率越快催化活性越強，但單獨的納米Au、Ag在介質中易團聚從而降低了其催化活性，以Au為核，將Ag負載在其表面合成納米Au@Ag復合材料不僅可解決團聚問題，納米Au@Ag復合后d軌道電子重合，電子云密度降低，而提高其穩定性，且增加對H-的吸附與脫附能力而具備較強的催化活性。

圖4 相同質量(0.1 mg)的 Au (a), Ag (b)和Au@Ag (c)對甲基橙催化降解過程吸光度的變化，標準品對氨基苯磺酸鈉的吸收光譜(d).Fig 4 Absorbance change during the catalytic with the same mass (0.1 mg) degradation of methyl orange using Au (a), Ag (b) and Au@Ag (c), and absorption spectra of standard sodium sulfanilate (d)

圖5 甲基橙直接烷化的機制Fig 5 A mechanism path for the direct alkylation of methyl orang

2.4 復合材料光抑菌活性

2.4.1 濾紙片擴散實驗結果

圖6為納米Au、Ag和Au@Ag對E.coli和S.aureus的濾紙片擴散抑菌結果。A、B和C分別為納米Au、Ag和Au@Ag，a1-a4代表材料濃度為100、200、300和400 μg/mL在黑暗條件下對細菌的抑制結果，圖6(b1-b4)為300 W(日光燈)下同濃度的光抑菌結果，由圖6(a1-a4)可知，黑暗環境下納米Au周圍未出現透明的抑菌圈，證明納米Au在400 μg/mL濃度以下幾乎沒有抑菌性能，納米Ag和Au@Ag周圍出現明顯的抑菌圈，且納米Au@Ag隨著濃度增大抑菌圈逐漸增大，說明抑菌活性和濃度呈正比，具體的抑菌圈直徑統計結果如表1所示，且材料在300 μg/mL處對兩種菌的抑菌效率較高。圖6(b1-b4)是在日光燈下不同材料對細菌的抑制結果，圖中Au在光照下均沒有抑菌性，對比黑暗環境下，而納米Ag和Au@Ag在光照條件下的抑菌圈更大，證明光照下納米Ag和Au@Ag的抑菌活性更強，同條件下對比納米Ag和Au@Ag的抑菌圈，納米Au@Ag的較大，說明納米Au@Ag的抑菌活性更強。同條件同濃度下對比E.coli和S.aureus的抑菌性能，Ag和Au@Ag對E.coli的抑菌活性更強，說明對E.coli更為敏感。通過濾紙片擴散結果可知，納米Ag和Au@Ag的抑菌活性和濃度呈正比，且在300 μg/mL處抑菌效率更高，光照條件下抑菌活性比黑暗條件下更高，對E.coli的抑菌效果更強，對比兩種材料，納米Au@Ag抑菌性能更強，證明把納米Ag負載在Au表面可明顯提高其抑菌活性。

表1 Au@Ag在不同濃度不同條件下對E. coli 和 S. aureus的抑菌圈直徑測試結果Table 1 Detailed zone diameters of the inhibition test results for the Au@Ag composites with different concentrations of different conditions against E. coli and S. aureus

圖6 不同濃度的不同條件下 Au(A)、 Ag(B)、 Au@Ag(C)對大腸桿菌(a, b)和金黃色葡糖球菌(c, d)的濾紙片擴散照片，a1, b1: 100 μg/mL, a2, b2: 200 μg/mL, a3, b3: 300 μg/mL, a4, b4: 400 μg/mL, c:黑暗培養, d: 光照培養Fig 6 Inhibition zones of the as-synthesized Au(A), Ag(B) and Au@Ag(C) composites with different concentrations of different conditions against E. coli (a, b) and S. aureus (c, d), a1, b1: 100 μg/mL; a2, b2: 200 μg/mL; a3, b3: 300 μg/mL; a4, b4: 400 μg/mL;a, c:culture in darkness; b, d: culture under light

2.4.2 菌落計數法實驗結果

圖7為在300 W的日光燈下，納米Au@Ag在300 μg/mL濃度下的時間抑菌結果。圖7(a)為材料對E.coli的抑菌結果，圖7(b)為S.aureus，O為參照，A、B、C和D分別為混合材料的細菌溶液在光照5 min、10 min、20 min和40 min后取10 μL上清液加入固體LB培養基中，37 ℃培養12 h的抑菌結果，由圖可知，E.coli中的O、A、B、C和D的菌落數分別為1 100、300、50、5、0個，而S.aureus中菌落分別為1 180、500、100、10、0個，通過對比可知，濃度為300 μg/mL時，納米Au@Ag對E.coli和S.aureus40 min內的抑菌率為為100%，而10 min內納米Au@Ag對E.coli的抑菌率較高，且這與濾紙片擴散結論剛好一致。

圖7 Au@Ag對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的不同光照時間抑菌菌落計數法分析Fig 7 Analysis of bacteriostatic colony counting method in different illumination time with Au@Ag against E. coli (a) and S. aureus (b)

2.4.3 細菌生長曲線實驗結果

圖8為納米Au@Ag在光照10 min，材料濃度為300 μg/mL的微量熱分析結果。由圖8(a，b)可知，對照中E.coli和S.aureus的4個生長階段遲緩期、對數期、穩定期和衰退期中，從遲緩期到對數期的時間是5.6與6.0 min，熱釋放強度為4.4 和4.0 mW，且對數期和穩定期間距(生長階段)時間較短，混合納米Au@Ag后對E.coli和S.aureus的遲緩期變為50 和58 min，相比對照的對數期和穩定期間距時間為85 與65 min。通過對比穩定期的熱流強度，混合材料組熱流均降低，且E.coli更為明顯，證明有部分細菌死亡。從圖中可以證明材料可有效抑制細菌適應能力，相比對照，延緩期變長與穩定期熱流強度降低是因為在光照過程中，溶液中存有部分ROS可有效殺死細菌，且納米Au@Ag在溶液中釋放的Ag+可使抑制細菌生長而使細菌生長階段時間變長，且使穩定期呼吸放熱量降低。

圖8 Au@Ag對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的微量熱分析Fig 8 Microcaloric analysis of Au @ Ag on E.coli (a) and S.aureus (b)

2.4.4 PI染色分析結果

圖9為納米Au@Ag在光照10 min，濃度為300 μg/mL下對E.coli和S.aureus的活死菌PI染色分析結果。紅色斑點為死菌。圖9(a、b)分別為參照和混合材料后的E.coli形貌結果，9(c、d)為參照與材料對S.aureus形貌的影響結果。由圖可知，參照中E.coli和S.aureus的中有少量的紅色斑點，且分別為條狀和環狀，材料對E.coli和S.aureus的染色結果中出現大量的條狀和環狀斑點，條狀斑點呈現不規則現象，環狀斑點的外圓環部分不完整，證明桿狀的E.coli的細胞壁被納米Au@Ag材料破壞的較為徹底，細胞壁破損導致細菌形貌發生改變，PI染色劑進入細菌內部和質粒中的DNA作用而出現無規則紅色斑點形狀，而S.aureus為球狀，材料破壞細胞壁后，PI染色劑進入細菌內部和擬核、質粒中DNA染色而出現環狀斑點，而環狀斑點較為完整，證明材料對S.aureus的細胞壁損傷程度一般。通過對比可知，材料對E.coli抑制能力較強，這與以上抑菌結果一致。其可能的抑菌機理為[23-25]：在日光等的照射下，納米Au@Ag表面電子發生局域等離子共振，部分電子逸出界面，與水介質結合生成ROS且釋放Ag+，E.coli和S.aureus細胞壁中都含有帶負電荷的脂多糖和磷壁酸(圖10所示)，可將Ag+吸附在其表面，Ag+由于與Cu+結構相似，可通過Cu粒子通道進入細菌內部破壞粒子通道、超氧化物歧化酶(SOD)、功能蛋白，協同ROS對細菌細胞器造成不可逆損傷而使細菌死亡。而納米Au@Ag對大腸桿菌更為敏感，主要原因是E.coli細胞壁中含有大量的脂多糖蛋白和少量的磷脂雙分子層，而S.aureus中含有更多的磷脂雙分子層，材料很難滲透或破壞磷脂雙分子層，但更易和蛋白質中的含-SH和NH2結合改變蛋白質二級結構而使細菌死亡。

圖9 Au@Ag對大腸桿菌(b)和金黃色葡萄球菌(d)的PI染色分析Fig 9 PI staining analysis of Au@Ag on E. coli (b) and S. aureus (d)

圖10 Au@Ag對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌機理Fig 10 Antibacterial mechanism of Au@Ag to E. coli and S. aureus bacteria

3 結 論

(1)以納米Au為核，在其表面負載Ag合成核殼型納米Au@Ag復合材料，通過TEM、EDX、UV-Vis對材料的形貌和元素進行分析，結果表明納米Au@Ag為單分散核殼型結構，且分別以單質的形式存在，這不僅可解決Ag團聚問題，且有效提高其穩定性。

(2)因納米Au@Ag具有豐富的表面等離子體，在300 W的日光燈的輻射下表面電子逃逸，與介質溶液結合生成ROS而具備協同抑菌性能，且雙金屬復合可有效降低電子密度，提高對質子的吸附和脫附能力而具備較強的催化加氫活性，在研究對甲基橙的催化加氫活性中證明，材料在10 min內對甲基橙的降解率為99%以上，對E.coli和S.aureus的抑菌研究中證明，材料在光照下抑菌活性更強，在濃度為300 μg/mL，光照10 min的抑菌效率更高，其主要原因是生成的ROS和Ag+可對細菌的生長階段造成嚴重的損傷，且對E.coli的細胞壁破壞更為嚴重。

(3)納米Au@Ag具有優越的催化加氫和抑菌活性可應用于污水處理和醫療器械等領域。