紅錐花粉離體萌發(fā)適宜條件及貯藏方法

郝海坤，申文輝，曹艷云，黃志玲，譚長強(qiáng)

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)和草原局中南速生材繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530002）

紅錐（Castanopsis hystrix）又名刺栲、紅栲，為殼斗科（Fagaceae）錐屬植物，是華南地區(qū)重要的鄉(xiāng)土闊葉珍貴用材和高效多用途樹種，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值，是華南地區(qū)主要造林樹種之一。20 世紀(jì)70年代以來，我國林業(yè)科研工作者開展了紅錐生物生態(tài)學(xué)、引種栽培、良種選育和生態(tài)評價等研究[1-5]，有力地推動了紅錐人工林的大面積發(fā)展。

人工控制授粉或雜交授粉是培育新品種的重要途徑，花粉采集、貯藏以及生活力檢測是雜交育種過程中的重要環(huán)節(jié)。花粉生活力受自身遺傳特性和外界因素的影響，不同物種花粉生活力不同，溫度和濕度是影響花粉壽命的重要因素。花粉在貯藏期間生命活動仍在進(jìn)行，將消耗有機(jī)酸、可溶性糖等營養(yǎng)物質(zhì)，花粉中的蛋白質(zhì)、酶和核酸等物質(zhì)也會變性，導(dǎo)致花粉生活力下降直至喪失，干燥和低溫是花粉貯藏的常用方法[6]。

染色法和離體萌發(fā)法是目前常用的兩種快速有效的花粉活力檢測方法。染色法快速、簡便，但具有選擇性。離體萌發(fā)法則對所有花粉都適宜，能測定花粉萌發(fā)率和花粉管長度、觀察花粉萌發(fā)過程，是一種簡單、迅速的花粉活力檢測方法[7]，已在農(nóng)業(yè)和林業(yè)育種研究中得到廣泛應(yīng)用[8-10]。殼斗科的栗屬植物錐栗（Castanea henryi）、板栗（Castanea mollissima）已有花粉萌發(fā)特性研究報(bào)道[11-13]，但是關(guān)于紅錐花粉活力檢測和貯藏的研究尚未見報(bào)道。本研究通過測定萌發(fā)率和花粉管長度，探索紅錐花粉離體萌發(fā)的合適培養(yǎng)基和溫度，揭示紅錐花粉萌發(fā)特性和耐貯藏性，為今后開展紅錐人工授粉、新品種培育提供參考。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

紅錐花粉采自廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院樹木園62年生紅錐林（108°21′E，22°56′N）。在南寧，紅錐花期是3— 4月。2018年3月13日清晨采集未開放的紅錐花枝，于室內(nèi)進(jìn)行水培。次日早晨8:00 ～10:00剪下開放的花穗置于硫酸紙上，抖動花穗，花粉自然掉落于硫酸紙上，過200目篩得到純凈花粉用于試驗(yàn)。

1．2 花粉離體萌發(fā)條件試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)法（L16（45）），共設(shè)計(jì)16 個處理（表1）。采用液滴懸浮離體培養(yǎng)法，將不同濃度蔗糖和硼酸配制的培養(yǎng)液滴于載玻片上，用濾紙片蘸少許花粉置于液滴中，將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子保濕，放入不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參考大葉相思（Acacia auriculiformis）[14]、西南樺（Betula alnoides）[15]和柚木（Tectona grandis）[16]花粉萌發(fā)規(guī)律，每隔2、4、6、20 和24 h，在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)紅錐花粉萌發(fā)數(shù)量（以花粉管長度大于花粉粒直徑為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)），計(jì)算花粉萌發(fā)率（%）；花粉萌發(fā)數(shù)量穩(wěn)定后測定花粉管長度。每個載玻片上觀察2個視野，每處理4個重復(fù)。

表1 紅錐花粉離體萌發(fā)條件試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Experimental factors and levels of in vitro germination of C.hystix pollen

1．3 紅錐花粉貯藏條件試驗(yàn)

參考大葉相思花粉貯藏特性[17]，將新鮮紅錐花粉分成8 份，用硫酸紙包好，其中4 份放入密實(shí)袋中，另外4份放入裝有干燥硅膠的密實(shí)袋內(nèi)，密封袋口，標(biāo)記后分別置于常溫、5 ℃、-20 ℃和-80 ℃條件下保存。5、15、30、60 和365 天時，從花粉離體萌發(fā)條件試驗(yàn)中選出的最佳配方培養(yǎng)花粉，計(jì)算花粉萌發(fā)率并測定花粉管長度。每個載玻片上觀察2個視野，每處理4個重復(fù)。

1．4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件處理數(shù)據(jù)；采用SPSS 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2．1 蔗糖、硼酸及溫度對紅錐花粉萌發(fā)的影響

方差分析表明，蔗糖、硼酸及溫度對紅錐花粉萌發(fā)率均有顯著影響（P＜0．05），對花粉管長度的影響均不顯著（表2）。蔗糖最佳濃度為100 g/L，其花粉萌發(fā)率顯著高于150和200 g/L（P＜0．05），花粉管長度最長；硼酸最佳濃度為200 mg/L，其花粉萌發(fā)率顯著高于其他處理（P＜0．05），花粉管長度最長；花粉萌發(fā)的最佳溫度為25 ～30 ℃，其中25 ℃花粉萌發(fā)率最高，30 ℃花粉管長度最長。

表2 3個因素對紅錐花粉離體萌發(fā)的影響Tab.2 Effects of three factors on pollen germination of C.hystrix

處理6 的效果最好，花粉萌發(fā)率為28．23%，花粉管長度為260．45 μm，均顯著大于其他處理（P＜0．05）（表3）。紅錐花粉萌發(fā)的最適條件為25 ℃條件下，采用100 g/L 蔗糖+200 mg/L 硼酸培養(yǎng)液。在此條件下培養(yǎng)1 h未見花粉管伸出，2 ～4 h花粉管開始萌發(fā)，6 ～16 h 為花粉萌發(fā)高峰時段，24 h 后萌發(fā)停止，平均花粉管長度為260．45 μm。

表3 不同處理對紅錐花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Tab.3 Effects of different treatments on pollen germination rate and pollen tube length of C.hystrix

2．2 貯藏條件對紅錐花粉萌發(fā)率的影響

紅錐花粉離體萌發(fā)最佳處理為100 g/L 蔗糖+200 mg/L 硼酸培養(yǎng)液、在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。采用此條件培養(yǎng)貯藏的花粉，測定其萌發(fā)情況。除在室溫貯藏30 天時，紅錐花粉萌發(fā)率為0 外，隨時間延長，其他處理的花粉萌發(fā)率均呈現(xiàn)下降-回升-下降的現(xiàn)象。

貯藏5 天時，4 ℃+ 干燥劑貯藏的花粉萌發(fā)率最高（27．72%），其次為-80 ℃+ 干燥劑貯藏（27．64%），比貯藏前分別降低1．81%和2．09%；常溫貯藏最低（14．32%），顯著低于其他處理（P＜0．05），比貯藏前降低49．27%；其他貯藏條件的萌發(fā)率為24．31%～25．54%（表4）。

表4 不同貯藏時間和貯藏條件的紅錐花粉萌發(fā)情況Tab.4 Pollen germination of C.hystrix stored at different time and different conditions

續(xù)表4 Continued

貯藏15 天時，-20 ℃+干燥劑貯藏的花粉萌發(fā)率最高（22．21%），其次為-80 ℃+ 干燥劑貯藏（21．36%），比貯藏前分別降低21．32%和24．34%；常溫貯藏最低（2．67%），顯著低于其他處理（P＜0．05），比貯藏前降低81．07%；其他貯藏條件的萌發(fā)率為12．36%～18．88%。

貯藏30 天時，除常溫的萌發(fā)率為0 外，其他處理萌發(fā)率均有所回升，且與貯藏前的萌發(fā)率相近。-20 ℃+ 干燥劑貯藏的花粉萌發(fā)率最高（31．21%），其次為-80 ℃+干燥劑貯藏（30．52%），顯著高于其他處理（P＜0．05），比貯藏前分別高出10．56%和8．11%；-20 ℃貯藏較低（24．10%），比貯藏前降低14．63%；常溫貯藏的花粉已無萌發(fā)力；其他貯藏條件的萌發(fā)率為26．81%～28．42%。

貯藏60 天時，-20 ℃貯藏的花粉萌發(fā)率最高（31．31%），其次為4 ℃+ 干燥劑貯藏（30．84%），比貯藏前分別高出10．91%和9．24%；常溫+干燥劑貯藏較低（16．12%），比貯藏前降低42．90%；常溫貯藏的花粉已無萌發(fā)力；其他貯藏條件的萌發(fā)率為23．90%～30．49%。

貯藏365 天時，-20 ℃+ 干燥劑貯藏的花粉萌發(fā)率最高（30．54%），比貯藏前高出8．18%；其次為-20 ℃貯藏（27．56%），比貯藏前降低2．37%；4 ℃貯藏的花粉萌發(fā)率較低（4．17%），比貯藏前降低85．23%；常溫和常溫+ 干燥劑貯藏的花粉已無萌發(fā)力；其他貯藏條件的萌發(fā)率為16．16% ～26．43%。

2．3 貯藏條件對紅錐花粉管萌發(fā)長度的影響

授粉成功還要有足夠長的花粉管，才能保證花粉管到達(dá)子房與胚珠結(jié)合。貯藏5 天時，-80 ℃+干燥劑貯藏的花粉管最長（177．58 μm），其次是-20 ℃+干燥劑貯藏（165．10 μm），均顯著大于其他處理（P＜0．05），比貯藏前分別降低31．82%和36．61%；常溫貯藏最短（79．17 μm），比貯藏前降低69．60%；其他處理的花粉管長度為80．81 ～136．21 μm。

貯藏15天時，4 ℃貯藏的花粉管最長（94．90 μm），其次為-20 ℃+干燥劑貯藏（92．30 μm），比貯藏前分別降低63．56%和64．56%；常溫貯藏最短（48．86 μm），顯著低于其他處理（P＜0．05），比貯藏前降低81．24%；其他處理花粉管長度為75．49 ～85．76 μm。

貯藏30天時，-80 ℃+干燥劑貯藏的花粉管最長（89．39 μm），其次為-20 ℃+ 干燥劑貯藏（88．30 μm），比貯藏前分別降低65．68%和66．10%；4 ℃貯藏的花粉管長度較短（55．46 μm），顯著低于其他處理（P＜0．05），比貯藏前降低78．71%；其他處理的花粉管長度為76．99 ～85．08 μm，差異不顯著。

貯藏60 天時，-80 ℃+干燥劑貯藏的花粉管最長（101．29 μm），其次為-20 ℃貯藏（86．29 μm），比貯藏前分別降低61．11%和66．87%；4 ℃貯藏的花粉管長度較短（50．04 μm），比貯藏前降低80．79%；其他處理的花粉管長度為32．20 ～85．11 μm。

貯藏365 天時，-20 ℃+ 干燥劑貯藏的花粉管最長（108．61 μm），其次為-80 ℃+ 干燥劑貯藏（95．65 μm），比貯藏前分別降低58．30%和63．28%；4 ℃的花粉管長度較短（32．81 μm），比貯藏前降低87．41%；其他處理的花粉管長度為52．82 ～83．40 μm。

3 討論與結(jié)論

離體萌發(fā)測定法對所有貯藏花粉或新鮮花粉都適宜，其中以液體培養(yǎng)法最簡便[18]。蔗糖作為花粉萌發(fā)的基本培養(yǎng)基，可為花粉萌發(fā)提供營養(yǎng)，還可以調(diào)節(jié)花粉細(xì)胞的滲透壓；硼參與花粉管頂端細(xì)胞壁的形成，因此添加適量的蔗糖和硼能夠促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管伸長。不同植物花粉的產(chǎn)量、萌發(fā)特性均受遺傳特性和環(huán)境等因素的影響。錐栗花粉最適萌發(fā)條件為在30 ～35 ℃環(huán)境下，采用5% ～7．5%蔗糖+ 400 ～900 mg/kg 硼酸作培養(yǎng)基[13]；西南樺花粉最適萌發(fā)條件為在30 ℃環(huán)境下，采用15%蔗糖+200 mg/kg 硼酸作培養(yǎng)基[15]；柚木花粉最適萌發(fā)條件為在29～33 ℃條件下，采用200 g/L 蔗糖+200 mg/kg 硼酸作培養(yǎng)基[16]；大葉相思花粉最適萌發(fā)條件為在30 ℃條件下，采用200 g/L蔗糖+300 mg/kg硼酸作培養(yǎng)基[14]；臺灣榿木（Alnus formosana）花粉最適萌發(fā)條件為在25 ℃條件下，采用10%蔗糖＋100 mg/L硼酸做培養(yǎng)基[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅錐花粉在25 ～30 ℃條件下，采用100 g/L蔗糖+200 mg/L硼酸的培養(yǎng)液能較好地萌發(fā)。

低溫和干燥有利于花粉貯藏。本試驗(yàn)中，紅錐花粉在-20 ℃+干燥劑或-80 ℃+干燥劑貯藏條件下，效果較好；貯藏365 天時，萌發(fā)率仍有30．54%和26．43%，與貯藏前相比變化不大，花粉管長度分別為108．61和95．65 μm，比貯藏前分別降低58．30%和63．28%。這與大葉相思和柚木[16-17]相似；錐栗和白花樹（Styrax tonkinensis）花粉在非干燥、-80 ℃低溫環(huán)境貯藏效果較好[20-21]。經(jīng)貯藏的花粉，其授粉結(jié)實(shí)能力需進(jìn)行田間授粉試驗(yàn)才能確定。

除在室溫貯藏30 天時，紅錐花粉萌發(fā)率為0外，隨時間延長，其他處理的花粉萌發(fā)率均呈現(xiàn)下降-回升-下降的現(xiàn)象。這與大葉相思、白花樹、梨、棗（Ziziphus jujuba）和酸棗（Ziziphus jujubavar．spinosa）花粉經(jīng)低溫干燥的萌發(fā)特性相似[17，22-24]。劉孟軍等[24]認(rèn)為這是短期被迫休眠現(xiàn)象，其原因之一可能是干燥使得與花粉萌發(fā)有關(guān)酶的活性暫時受到抑制；另一方面，可能與部分未成熟花粉在貯藏過程中進(jìn)一步后熟有關(guān)。具體原因有待進(jìn)一步研究。

花粉是種子植物自然條件下遺傳信息交流的載體，包含了該物種的所有基因類型，是植物種質(zhì)材料之一，花粉的長期貯藏是種質(zhì)資源保存和利用中的一項(xiàng)重要課題。低溫冷凍貯藏只適于花粉的中、短期保存，超低溫（液氮，-196 ℃）保存被認(rèn)為是花粉保存的新途徑。有研究表明，白掌（Spathiphyllum floribundum）花粉-196 ℃下貯藏2年，活力沒有損失[25]；山茶（Camellia japonica）花粉經(jīng)液氮保存13 ～20個月后，平均萌發(fā)率為53．2%，田間授粉結(jié)實(shí)率與當(dāng)年新鮮花粉差異很小[26]。李秉玲等[27]的研究也表明絕大部分芍藥（Paeonia lactiflora）品種花粉超低溫保存4年后相對保持率＞50%，超低溫保存的花粉中，大部分品種花粉的萌發(fā)率顯著高于新鮮花粉，人工授粉后仍具有受精結(jié)實(shí)能力。紅錐花粉是否能用此方法達(dá)到長期貯藏的目的需進(jìn)一步研究。