瑞舒伐他汀鈣聯合二甲雙胍通過調控葡萄糖轉運蛋白4表達發揮對糖尿病大鼠腎臟的保護作用研究

尚葛礎，王瀟永，高燕

本研究價值：

（1）目前糖尿病的發病率不斷增加，各類藥物對腎臟的影響亟須獲得更高程度的關注，然而他汀類藥物對腎臟的保護作用還未得到充分研究，尤其現在關于他汀類藥物是否引發新發糖尿病還存在一定爭議。本研究通過動物實驗發現瑞舒伐他汀鈣聯合二甲雙胍對2型糖尿病（T2DM）大鼠腎臟具有保護作用，可能與調控腎臟葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）mRNA及蛋白的表達有關。

（2）本研究通過研究不同劑量瑞舒伐他汀鈣聯合二甲雙胍對T2DM大鼠腎臟的組織學（HE染色、PAS染色、Masson染色）變化及GLUT4 mRNA、GLUT4蛋白表達的影響，發現其可通過改善胰島素抵抗、氧化應激、腎臟纖維化、抑制細胞凋亡等作用保護腎臟，從蛋白與mRNA角度觀察劑量與腎臟病理性改變的關系，且保護作用與藥物劑量呈正相關。

近年來，隨著經濟發展、老年人比例的增加及超重、肥胖等患病率的增加，我國2型糖尿病（T2DM）發病率顯著上升［1］。血管內皮細胞損傷、炎性反應、氧化應激和胰島素抵抗等是T2DM發展的獨立危險因素［2］。瑞舒伐他汀鈣是一種強效的降脂藥物，親水性優于其他同類藥物，對肝臟損害較小。有研究表明，瑞舒伐他汀鈣對腎臟同樣具有保護作用，可降低炎性因子水平、改善血管內皮功能、抗氧化及提高胰島素敏感性［3-4］。二甲雙胍是臨床治療T2DM的常見藥物，可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），保護腎小管細胞免受炎癥、凋亡、活性氧（ROS）應激、內質網（ER）應激、上皮-間充質轉化（EMT）的影響，還具有抑制系膜細胞凋亡和腎小管細胞衰老的作用［5］。章超等［6］研究發現，瑞舒伐他汀聯合二甲雙胍能改善T2DM患者血糖、血脂水平，控制炎性反應，緩解胰島素抵抗（insulin resistance，IR），具有重要的臨床價值。本研究觀察了瑞舒伐他汀鈣聯合二甲雙胍對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的T2DM大鼠腎臟組織結構學、葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）mRNA及蛋白表達的影響，以探討其在T2DM大鼠腎臟損傷中的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2021年7—10月選用清潔級健康雄性Wistar大鼠40只，8周齡，體質量（200±20）g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司〔SCXK（魯）2019-0003〕，動物合格證號：370726210100677087，飼養于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六〇醫院動物飼養中心〔SYXK（魯）2012-0043〕，將大鼠飼養于室溫21～25 ℃、空氣流通的環境中進行1周的適應性飼養。本實驗由中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六〇醫院倫理委員會審查通過（20210123）。動物飼料由北京博泰宏達生物技術有限公司配制，主要營養成分：蛋白質24.2%，碳水化合物42.1%，脂肪25.4%。

1.2 實驗藥物及試劑 瑞舒伐他汀鈣（商品名：可定），阿斯利康藥業（中國）有限公司生產。二甲雙胍（商品名：格華止），中美上海施貴寶制藥有限公司生產。中性樹膠、無水乙醇與二甲苯由國藥集團化學試劑有限公司提供。乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0）抗原修復液、EDTA（pH 9.0）抗原修復液、檸檬酸（pH 6.0）抗原修復液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、自發熒光淬滅劑、牛血清白蛋白、DAPI染色劑、一抗、熒光二抗、抗熒光淬滅封固劑均購自武漢谷歌生物科技有限公司。蘇木素-伊紅（HE）染色液、分化液、返藍液、RNA提取液及引物均由Servicebio廠家提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病動物模型建立、分組及喂藥

1.3.1.1 糖尿病動物模型建立 大鼠適應性喂養1周后，建模大鼠給予高糖、高脂飼料繼續喂養6周，采取腹腔一次性注射STZ（40 mg/kg）的方法建造模型，空腹8 h后采用尾靜脈穿刺法檢測大鼠基線血糖水平，若空腹血糖（FBG）>11.1 mmol/L，則提示成功建立STZ誘導的T2DM模型。

1.3.1.2 分組及喂藥 40只Wistar大鼠隨機分為對照組（C組）、二甲雙胍組（M組）、瑞舒伐他汀鈣低劑量+二甲雙胍組（M+RL組）及瑞舒伐他汀鈣高劑量+二甲雙胍組（M+RH組）4組，每組10只。給予各組藥物灌胃：C組：10 mg·kg-1·d-10.9%氯化鈉溶液；M組：二甲雙胍（200 mg·kg-1·d-1）；M+RL組：二甲雙胍（200 mg·kg-1·d-1）混懸液+瑞舒伐他汀鈣（0.42 mg·kg-1·d-1）；M+RH組：二甲雙胍（200 mg·kg-1·d-1）混懸液+瑞舒伐他汀鈣（0.83 mg·kg-1·d-1）。干預6周，末次給藥后，次日大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（1 mg/300 g），切開腹腔并摘取腎臟，留取腎臟組織標本送檢。

1.3.2 HE染色 HE染色步驟如下：（1）將腎臟組織進行石蠟包埋，常規脫蠟至水；（2）蘇木素染色5 min后，使用蒸餾水沖洗；（3）伊紅染色1 min，再次蒸餾水浸泡沖洗；（4）脫水，并使用中性樹膠封固；（5）在光鏡下對腎臟組織切片進行觀察和分析。

1.3.3 高碘酸-無色品紅（PAS）染色 PAS染色步驟如下：（1）將組織薄片常規脫蠟至水；（2）加入高碘酸染色10 min，蒸餾水沖洗；（3）用雪弗試劑孵育15 min，流水沖洗5 min，組織變為深粉紅色后蒸餾水沖洗；（4）蘇木素復染2 min，梯度乙醇脫水；（5）二甲苯透明，中性樹脂封固。各切片隨機挑選至少3個200倍視野并拍照，應用Image-Pro Plus 6.0軟件測量區域紫紅色陽性面積百分比。

1.3.4 Masson染色 Masson染色步驟如下：（1）腎臟石蠟切片鉻酸鉀染色；（2）鐵蘇木素染核10 min，蒸餾水沖洗；（3）麗春紅酸性品紅染色10 min，冰醋酸水溶液短暫浸泡；（4）磷鉬酸染色5 min；（5）苯胺藍染色5 min，進行分化與透明封固。使用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測200倍視野區域藍色膠原纖維面積百分比。

1.3.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達水平 取100 mg大鼠的腎臟組織，抽提RNA，進行反轉錄，根據ΔΔCt法對大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA進行基因定量。PCR擴增引物序列見表1。

1.3.6 Western-blotting法檢測藥物對大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達的影響 將腎臟組織徹底勻漿并完全裂解，收集總蛋白溶液，按4∶1的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，通過Western-blotting法檢測腎臟組織中GLUT4蛋白表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 HE染色可見：C組大鼠腎臟組織無病理樣改變，腎小管排列緊密，腎小球未見明顯異常。M組大鼠腎小球萎縮，腎小管數量減少，腎臟組織內可見炎性細胞浸潤，伴有間質水腫與出血，腎實質可見褐色素沉著。M+RL組腎小球及腎間質均有大量炎性細胞浸潤，腎小管輕度水腫，管腔內可見嗜伊紅蛋白樣物質，胞核固縮深染，腎小管間質血管淤血。M+RH組腎小管擴張，部分腎小球肥大，基膜增厚（圖1）。

圖1 各組大鼠腎臟組織形態學變化（HE染色）Figure 1 Morphological changes of kidney tissues stained with H&E in control rats and streptozotocin-induced T2DM rats

2.2 PAS染色結果 PAS染色可見：C組大鼠腎小球均勻光滑，腎小管基膜及系膜基質無明顯病理性改變，腎小球血管袢薄，未見腎小球肥大及腎小管管型。M組大鼠腎組織損傷明顯，腎小球基底膜明顯增厚，系膜細胞及基質增多，部分腎小管出現空泡樣病變，管腔擴張，可見腎間質水腫。M+RL組可見腎小管毛細血管壁增厚，可見毛細血管袢塌陷，腎小管基底膜增厚，可見腎小管管型。M+RH組腎小球基底膜較C組增厚，腎小管管腔擴張，系膜細胞明顯增多（圖2）。

圖2 各組大鼠腎臟組織形態學變化（PAS染色）Figure 2 Morphological changes of kidney tissues stained with periodicacid schiff in control rats and streptozotocin-induced T2DM rats

C組PAS染色陽性面積百分比為（1.67±0.41）%，M組為（5.32±1.72）%，M+RL組為（4.91±0.83）%，M+RH組 為（4.55±0.27）%， 各 組 PAS染 色 陽 性面積百分比比較，差異有統計學意義（F=8.509，P=0.007）； 其 中M組、M+RL組、M+RH組PAS染色陽性面積百分比均高于C組，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3 Masson染色 Masson染色結果顯示：C組腎小球基底膜、系膜基質均正常，無壞死性病變，未觀測到間質纖維化。M組腎小管嚴重萎縮，腎小球內免疫復合物沉積，出現大量藍色膠原纖維、纖維素樣壞死及血管血栓。M+RL組有大量腎小球基底膜空泡，出現間質纖維化，腎小球內可檢測到大量藍色膠原纖維。M+RH組腎小球存在少量特殊沉積物，腎小管輕度萎縮，間質有較多藍色膠原纖維（圖3）。

圖3 各組大鼠腎臟組織形態學變化（Masson染色）Figure 3 Morphological changes of kidney tissues stained with Masson's trichrome in control rats and streptozotocin-induced T2DM rats

C組藍色膠原纖維面積百分比為（2.33±0.82）%，M組為（21.26±1.55）%，M+RL組為（14.08±6.40）%，M+RH組為（9.86±2.19）%，各組藍色膠原纖維面積百分比比較，差異有統計學意義（F=15.423，P=0.001）；其中M組、M+RL組、M+RH組藍色膠原纖維面積百分比均高于C組，M+RL組、M+RH組藍色膠原纖維面積百分比均低于M組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 4組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達水平比較 C組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達水平為（1.06±0.39），M 組 為（0.27±0.03），M+RL組 為（0.62±0.21），M+RH組為（1.02±0.34），4組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（F=10.526，P<0.001）；其中M組、M+RL組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達水平均低于C組，M+RL組、M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達水平均高于M組，M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達水平高于M+RL組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.5 4組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達水平比較 C組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達水平為（0.80±0.10），M 組 為（0.23±0.04），M+RL組 為（0.41±0.10），M+RH組為（0.53±0.04），4組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（F=50.764，P<0.001）；其中M組、M+RL組、M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達水平均低于C組，M+RL組、M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達水平高于M組，M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達水平高于M+RL組，差異均有統計學意義（P<0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠GLUT4蛋白相對表達量Figure 4 The relative expression levels of glucose transporter 4 protein in control rats and streptozotocin-induced T2DM rats

3 討論

T2DM是一種以血糖水平升高為主要特征的代謝類疾病，近年來，糖尿病患病率不斷上升，死亡率也居高不下［7］。受胰島素分泌不足、胰島功能缺陷等影響，糖尿病有發展為慢性腎臟疾病（CKD）的風險，而CKD是導致糖尿病患者死亡的重要原因之一［8］。

他汀類藥物具有抗炎作用，可減少炎性細胞和細胞因子的數量，降低C反應蛋白水平［9］。瑞舒伐他汀通過甲羥戊酸-類異戊二烯途徑抑制與缺血/再灌注（I/R）相關的超氧化物歧化酶（SOD）的形成，抑制炎性細胞浸潤［10］。本研究結果表明，瑞舒伐他汀鈣聯合二甲雙胍具有抗炎作用，HE染色與PAS染色的結果從組織形態學角度顯示，藥物緩解了腎小球與腎小管的炎性細胞浸潤進程，腎間質水腫與出血程度、腎小球與腎小管損傷程度均有所減輕，且藥物劑量增加后，腎臟組織病變程度減輕。

他汀類藥物可通過抗炎作用，抑制腎臟組織氧化應激，延緩腎小球的損傷，促使足細胞與限制系膜細胞增殖，發揮其對腎臟的保護作用。瑞舒伐他汀是一種親水性他汀，相較于阿托伐他汀在血漿中14 h左右的t1/2，瑞舒伐他汀的t1/2可達19 h，單藥可使低密度脂蛋白下降30%～50%，抗炎及抑制氧化應激方面療效更突出［11］。

腎臟組織纖維化是導致腎功能下降的重要病理機制，有研究表明，高脂血癥可導致腎小球硬化與腎纖維化，瑞舒伐他汀可通過減少三酰甘油的積累，達到降脂的目的，同時抑制肌成纖維細胞功能，減少細胞外間質（ECM）的產生，抑制腎小管對蛋白質的再吸收，進而抑制小管間質纖維化，并通過Smad依賴與Smad獨立通路緩解腎纖維化的進程［12-14］。本研究的Masson染色結果顯示，瑞舒伐他汀鈣聯合二甲雙胍可顯著改善T2DM大鼠腎臟組織中膠原纖維排列紊亂、間隙增加、纖維樣壞死增加的情況，減少血管血栓，發揮其抑制腎臟組織纖維化的作用。

他汀類藥物具有多效性，可通過穩定腎血管內皮細胞和清除氧自由基來發揮抗氧化特性，進而預防腎缺血［15］。有研究表明，瑞舒伐他汀鈣通過抑制依賴還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的超氧陰離子（O2·-），上調細胞內的抗氧化劑如谷胱甘肽，緩解氧化應激，發揮抗氧化的作用，此外瑞舒伐他汀鈣還可降低活化的caspase-3的表達，抑制細胞凋亡，對腎臟具有保護作用［16-17］。

GLUT4是定位于腎小球、髓袢升支粗段、血管平滑肌部分的跨膜葡萄糖轉運蛋白，受胰島素調節，以胰島素依賴的方式攝取葡萄糖，在維持葡萄糖穩態方面發揮重要作用［18］。研究表明，他汀類藥物可誘導胰島素抵抗，降低脂肪組織中GLUT4的表達，造成胰島素增敏激素分泌不足，降低胰島素細胞功能，誘發新發糖尿病（new onset diabetes，NODM），且瑞舒伐他汀鈣對胰島素誘導的蛋白激酶b磷酸化和GLUT4向脂肪細胞膜轉運的影響比匹伐他汀更為顯著［19］。目前關于他汀類藥物劑量與NODM之間是否存在相關性還存在一定爭議，大量研究結果表明，高劑量他汀類藥物誘發NODM的風險更高，然而同樣有觀點認為，劑量并非增加糖尿病發病風險的關鍵因素，TAGUCHII等［20］通過一項包含13 054例患者的臨床研究發現，不同劑量的匹伐他汀對NODM的發病率并無明顯影響。本研究結果顯示，相較C組，M組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白表達水平均有所下降；與M組相比，藥物治療后大鼠腎臟組織中GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白表達明顯增加，提示兩藥聯合可通過調節GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白表達，改善胰島素抵抗，影響血糖代謝。同時M+RH組的腎臟損傷程度低于M+RL組，GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白表達水平均優于M+RL組，提示藥物劑量與腎臟保護作用呈正相關。

總之，瑞舒伐他汀鈣聯合二甲雙胍通過減輕腎小球及腎小管炎性細胞浸潤，緩解腎小球基底膜增厚、腎小管水腫及腎間質纖維化的進程，而這些保護作用可能與瑞舒伐他汀鈣聯合二甲雙胍調控腎臟GLUT4 mRNA的表達有關，兩藥聯用可顯著增加對T2DM大鼠腎臟的保護作用，且對腎臟的保護作用可隨藥物劑量的增加而上升。

作者貢獻：尚葛礎提出研究思路及主要研究指標，負責研究的實施、統計分析、論文撰寫與修改、后期審查；王瀟永負責數據整理、數據錄入、統計分析、圖片整理；高燕負責研究的設計、研究質量控制、指導論文撰寫及論文內容審校。

本文無利益沖突。