植物組織培養中抗污染培養基新配方研究

裘曉梅

（山西省桑干河楊樹豐產林實驗局，山西 大同 037006）

0 引言

就目前而言，植物組織培養技術屬于生物學研究重點，并且應用十分廣泛，能夠在為植物學科研工作開展提供保障的基礎上，有效優化植物生產。而污染率對于應用植物組織培養技術具有重要意義。以往行業主要通過對外植體進行消毒，并配合規范性操作，有效降低感染率，但是該方法存在耗時長的問題，并且仍無法實現對污染率的徹底控制，因此，強調行業應高度重視培養基抗污染工作，采取有效手段，在降低實驗室資源浪費的同時，最大程度上降低污染率。

1 實驗背景

既往研究顯示，培養基使用常見抗生素包括青霉素、利福平、頭孢霉素等，均具有一定的抗菌效果，而代森錳鋅、百菌清在觸殺真菌效果方面優勢顯著。多菌靈屬于內吸型抗菌藥物，益培靈屬于抗污染復合藥物。有研究表明，通過將益培靈應用在相關培養基實驗中，能夠起到良好的抗菌處理效果，但是在長期研究過程中發現，上述藥物抗菌效果均具有一定的局限性。例如，青霉素雖然不會對外植體產生較大的影響，但是因為其具有易分解的特性，使用后藥效時間相對較短，并且使用成本較高。多菌靈觸殺功能相對較差，并且在使用藥物后藥物生效時間相對較晚，利福平、頭孢霉素雖然具有一定的殺傷性，但是在單一使用的情況下，則需要加大劑量，并且上述藥物均需要建立在嚴格的組織培養下，才能夠取得抗菌效果。還有研究顯示，上述藥物均對于細菌能夠起到良好的抑制作用，在真菌污染方面抑制效果相對較差，并且需要耗費大量資金成本。因此，強調行業應加大對培養基抗菌研究工作，確保培養基抗菌效果[1]。

2 實驗材料

本文實驗使用材料包括甘薯組、煙草組培苗、擬南芥種子等。

3 實驗方法

3.1 配方篩選

本文在確定基礎培養基為MS 培養基后，經滅菌處理，共獲取12 種抑菌劑配方，詳見表1。所有配方均不添加封口處理，在25℃下保存15d，每個配方配套6 皿，并對雜菌生長情況進行觀察，完成抑菌劑配方篩選。在獲取到最佳配方后，應逐步減少藥劑濃度，確保在最低藥劑濃度下篩選出最佳抑菌劑配方。

表1 MS 培養基

3.2 擬南芥種子萌發實驗

取MS 培養基、MS 培養基（去除抑菌劑）、MS 培養基（CK）展開研究，取擬南芥種子，經1min 酒精消毒后，使用清水將擬南芥種子進行清潔，次氯酸消毒清洗后，放置在培養基中，每皿6 次，共計72 粒種子，在點播結束后，封口培養，觀察種子萌發、污染情況[2]。

3.3 甘薯組培苗再生影響實驗

取1 號配方作為實驗組，取MS 培養基（不存在抑菌劑）作為對照組，保持實驗室無菌環境，經45d 培養后，獲取甘薯莖段。每個培養基可添加三個莖段，在保持無菌環境的基礎上，對培養基進行為期一周的培養，其中，要求應將實驗室溫度控制在24℃，并將濕度控制在55%，觀察各組污染情況，記錄各組莖段生長情況。

3.4 煙草葉片誘導愈傷組織情況

取配方1 愈傷培養基作為實驗組，取愈傷培養基（不存在抑菌劑）作為對照組（CK），對煙草葉片培養30d，將煙草葉片切為葉盤，并在愈傷培養劑中進行培養，要求每皿培養基至少存在五個葉盤，并在遮光條件下進行15d 培養，拍照記錄，觀察培養基雜菌污染情況，并對葉盤愈傷組織進行觀察[3]。

3.5 甘薯組培材料驗證實驗

工作人員應提前準備已經受到污染的甘薯組培苗，進一步對該組培苗污染源進行判斷，如果外植體侵染病癥較為明顯，則視為侵染性污染，反之則為非侵染性污染，借助滅菌水，對莖段進行清洗，并將莖段分為兩個莖節，經酒精消毒后，使用滅菌水進行清洗，并放入配方1MS 培養基中。當存在侵染性污染時，則進一步進行酒精消毒，并將外植體暴露在空氣中，使用多菌靈粉末進行涂抹，并放置在多菌靈藥液中，完成浸潤處理，并進一步放置在配方1 培養基中，培養時間為10d，培養溫度為24℃，培養濕度為55%，觀察培養基存活率、污染率。

3.6 滅菌保存實驗

取甘薯莖段，滅菌預處理，并將其放置到配方1MS培養基中作為實驗組，選擇不進行滅菌預處理的藥液包衣添加到MS 培養基中作為對照組，觀察兩組材料保存效果[4]。具體操作如下：取甘薯幼嫩莖段，并對莖段侵染源情況進行檢查，去除掉侵染源莖段，清水沖洗切除，使其長度在3cm 以內，保持粗度在0.5～1.0cm 范圍內，并每個莖段保留莖節一個，如果莖段粗度超過0.5cm，則需要保留兩個莖節，酒精漂洗，清水沖洗，去除蟲卵，暴露莖段，并按照配方1 配比后，放置培養，觀察莖段存活率、污染率。

4 實驗結果

4.1 配方篩選結果

經本文研究，配方45d 內未出現雜菌污染情況，進一步展開實驗，在不改變處理條件、時間的情況下，通過合理控制變量，可獲取最佳濃度。具體可逐步降低頭孢霉素濃度，研究結果顯示，當頭孢霉素濃度達到20mg/L 時，存在細菌污染情況，劑量相對較少，因此，本文實驗最終確定頭孢霉素為25mg/L。逐步降低代森錳鋅濃度，將濃度達到20mg/L 時，將會出現真菌污染。因此最終確定最佳配方為頭孢霉素（25mg/L）、代森錳鋅（30mg/L）、百菌清，混合比例為1:1。

4.2 擬南芥種子萌發影響

分別取上文配方（處理1 組）、最優配方核心藥劑MS 培養基（處理2 組）以及不存在抑菌劑MS 培養基（對照組），觀察擬南芥種子萌發情況。實驗結果表明，經處理后，7d 內，三組均未發現雜菌情況，但是與處理2 組、對照組相比，處理1 組擬南芥種子萌發速度提升顯著，但是在最終萌發率方面，處理1 組與對照組無明顯差異。經研究顯示，處理2 組能夠提升種子前期萌發速度，但是在最終萌發率方面相對較低。

4.3 甘薯組培苗再生情況

經7d 培養后，處理1 組、處理2 組、對照組甘薯組培苗均未發現雜菌污染情況。對比三組根系生長情況，對照組根系生長速度最快，處理1 組、處理2 組可起到抑制甘薯組培苗根系生長的作用，并且與處理1 組相比，處理2 組抑制情況更加明顯，與對照組相比，經處理1 組、2 組培養后，可有效提升組培苗葉數，有利于優化組培苗生長勢態。

4.4 煙草葉片誘導愈傷組織情況

分別應用處理1 組、2 組以及對照組對煙草葉盤進行培養，培養需要在遮光環境下進行，培養時間為15d。結果顯示，經處理后，葉盤均未出現雜菌情況，在培養第5d，可在對照組中觀察到葉片膨脹情況，在實驗組中，葉片尚未形成翻卷情況，但是存在拱起現象。在第15d，對照組可發現明顯白色愈傷組織，但是在處理1組、2 組中，可發現少部分葉片愈傷現象。這說明通過采取最優抑菌劑，可有效抑制煙草葉盤誘導愈傷組織。

4.5 已污染甘薯組培苗再生情況

經研究表明，通過采取藥液包衣預處理，將已經存在污染情況的甘薯莖段添加到處理1 組MS 培養液中，經10d 培養，可有效緩解甘薯植株污染情況。同時，處理1 組培養液能夠對該培苗根系生長進行抑制。提示，在使用藥液包衣的基礎上，通過使用處理1 組培養基，可有效提升污染培苗存活率。

4.6 甘薯材料滅菌保存效果

本文研究結果表明，在單純使用處理1 組培養基培養的情況下，進入到初期階段，外植體并不會出現感染情況，但是當培養時間達到5d 后，外植體斷口處將會出現菌絲，并且在菌絲逐漸長大的情況下，培養基將會被入侵。而在使用多菌靈粉末以及藥液包衣后，通過將其放入到處理1 組培養基中進行培養處理，經7d 培養后，可有效優化甘薯材料生長狀態，并且在培養過程中，未出現雜菌污染現象。經多次實驗后，實驗結果顯示，為有效提升甘薯材料滅菌保存效果，除需要做好材料選擇外，還需要加強藥液包衣處理，并將其放置在處理1 組培養液中進行處理，可有效提升材料存活率。其中，應將材料直徑控制在0.4cm。

5 實驗分析

受到雜菌污染影響，將會導致組織培養質量下降，而現有抗污染技術主要強調營造無菌操作環境，進而降低培養基培養污染，該方法雖然能夠在一定程度上減少污染情況，但是往往伴隨高成本的問題，并且處理耗時相對較長，在抗污染不徹底的情況下，一旦出現雜菌污染，將會嚴重損害培養植體。而在本文研究中，頭孢霉素（25mg/L），代森錳鋅（30mg/L）并與百菌清經1:1混合，可取得最佳抑菌劑配方。經研究顯示，該配方能夠有效降低對植體的影響，有利于在最大程度上實現成本控制，進而促進甘薯組培材料繁殖以及保存。

以往有研究以彩葉草進行研究，研究結果發現，通過配置適量濃度百菌清，對彩葉草進行處理，可有效提高葉片生長量，而在提升百菌清濃度的基礎上，能夠對植物根系生長起到抑制作用，但是不會對頭孢霉菌產生影響。在本文研究中，通過采取最優配方，能夠在一定程度對植物根系生長進行抑制，但是能夠提升植物莖葉生長速度，并且具有抑制愈傷組織生長的作用。這說明百菌清在植物生長中具有重要作用。因此，針對藥物存在的生根抑制情況，要求工作人員應適量添加激素進行緩解，但是在選擇緩解材料過程中，應避免使用吸附類材料，以免培養基中存在的抗菌成本被吸附，導致培養基抗菌效果呈現下降狀態。本文實驗還發現，通過選取最優配方，能夠有效優化擬南芥種子發芽速度。有研究選擇不同劑量代森錳鋅進行研究，判斷其在種子發芽中的作用，研究結果發現，代森錳鋅能夠幫助部分蔬菜種子快速發芽。本文研究結果顯示，在最優配方中，代森錳鋅在提升擬南芥種子發芽的速度方面具有核心作用。

本研究進一步對已污染甘薯組培材料進行研究，研究結果顯示，通過應用最優配方，可有效促進組培材料擴大、繁殖，并且有利于材料滅菌、保存。本文研究出一種藥液包衣方法，可有效完成材料預處理工作，但是在藥液包衣組成成分不同的情況下，使用情況也有所不同，如果藥液包衣為多菌靈藥液，其屬于內吸型藥物，不具有良好的菌體觸殺功能，可將其應用在污染源單一的材料中，有利于提升防護效果。如果藥液包衣為代森錳鋅、百菌清混合液，則適用于更加復雜的污染源材料中，可有效提升抗菌效果。因此，在使用藥液包衣的基礎上，還應另外配合最優配方，確保在最大程度上實現污染風險防控，在單純使用藥液包衣的情況下，一旦沒有對菌群進行殺滅處理，同樣會增加培養基污染風險。本文研究還發現，加強甘薯材料滅菌保存具有重要意義。本文研究發現，如果莖段材料直徑在0.8～1.2cm 范圍內，具有較高的污染率，這主要與材料環境復雜性有關，在莖稈成熟度較高的情況下，表面具有更高的創面復雜性，也會在一定程度上增加雜菌附著、入侵風險，而當莖段直徑范圍在0.3～0.5cm 時，經培養后，污染率相對較低，因此，莖段最佳直徑為0.4cm。

6 結語

筆者研究發現，通過將頭孢霉素（25mg/L），代森錳鋅（30mg/L）并與百菌清經1:1 混合，可有效提升抑菌效果。同時，本文研究還發現，在使用該配方后，可有效優化擬南芥種子萌發速率、有利于優化甘薯組培苗生長、有效抑制煙草葉片誘導愈傷組織。同時，以該配方作為參考，進一步提出藥液包衣方法，有利于優化滅菌保存效果。