2種常見CRISPR-Cas系統在蘋果中的適用性特征

岳鵬 高海琴 李哲 米志波 鄭博 趙彥敏

摘要：運用生物信息學方法初步分析CRISPR-Cas9和Cpf1在蘋果中的整體適用性特征，以期為蘋果基因組編輯和CRISPR-Cas在蘋果研究中的推廣使用提供一定的參考和便利。結果表明，蘋果染色體中有數量可觀的PAM，平均間隔7 bp堿基有1個5′-NGG、間隔3 bp有1個5′-TTN;也就是說5′-TTN比5′-NGG的出現頻率高。SpCas9、FnCpf1分別有29.0%、26.9%的作用位點幾乎覆蓋了所有染色體基因，個別不能被SpCas9識別的基因能被FnCpf1識別，反之亦然。蘋果的CRISPR靶序列有大量重復，單一靶序列被視為能被Cas蛋白特異識別并有效編輯。在靶序列長度為20 nt時，99.5%的染色體基因可至少被其中1種Cas蛋白編輯，分別具有不同的可編輯度搭配;其中的237個基因只能被1種Cas蛋白編輯，填補了另一種Cas蛋白留下的編輯空白，另有220個染色體基因（0.5%）不能被任一種Cas蛋白編輯，即2種Cas蛋白同時留下編輯空白，沒有互補。

關鍵詞：蘋果;CRISPR-Cas;適用性特征;PAM出現頻率;基因編輯

中圖分類號：S661.101 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0043-08

收稿日期：2021-06-04

基金項目：中國成人教育協會“十四五”成人繼續教育科研規劃重點課題（編號：2021-323ZB）;河北省張家口市科技項目（編號：18110300043）;河北省張家口市社會科學立項研究課題（編號：2021121）。

作者簡介：岳 鵬（1984—），男，河北張家口人，碩士，講師，從事農林生命科學類和開放教育研究。E-mail：yppolymerase@foxmail.com。

通信作者：趙彥敏，博士，副教授，從事農林生命科學類和開放教育研究。E-mail：zym319@163.com。

蘋果（ Malus domestica ）是世界上主要果樹作物之一，其產量和質量易受生物和非生物脅迫的影響[1]。因此，了解抗逆性相關基因的功能及調控規律，對培育抗逆性強的品種至關重要[2]。與其他作物相比，果樹具有高度雜合的多倍體基因組且繁育周期長，導致傳統的育種研究進展緩慢[3];而隨著基因組測序工作的完成，對其基因結構、基因通路和基因功能的認識為基因編輯奠定了基礎[4]。高效、易用、省時、低成本的基因編輯技術是賦予果樹重要經濟性狀的捷徑。常間四文重復序列叢集關聯蛋白[CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）-Cas（CRISPR-associated proteins）]系統具備以上優勢，在研究生物多種類的精確分子機制方面具有極高的應用價值[5]。

當前，基因組編輯技術主要集中在第2類CRISPR-Cas系統[6];它可以使用單個效應蛋白剪切DNA，包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型[7]。其中，Ⅱ型的Cas9及其失去剪切活性的衍生品dCas9被廣泛應用于多種生物體的基因組操作，包括靶向基因干擾、轉錄激活抑制、表觀遺傳修飾及目標堿基對轉換[8-9]。經典的Cas9蛋白須識別銜接在靶序列（+）3′端形如5′-NGG 的前間隔序列鄰近基序（protospacer-adjacent motif，PAM，+），并在PAM上游第3個堿基處切割雙鏈，形成平頭末端;在人類基因組中約平均間隔8 bp就會有1個5′-NGG[10]。不同于此，Ⅴ型的Cpf1（Cas12a）要識別毗鄰在靶序列（+）5′端形似5′-TTN 的PAM（+），并在PAM下游的同向鏈（+）第18、互補鏈（-）第23堿基處交錯切割，形成有5個突出堿基的黏性末端[11]。作為新型且更小的CRISPR效應蛋白，Cpf1的開發利用有利于突破和克服Cas9在使用中的一些限制，尤其是拓寬了CRISPR-Cas系統的識別范圍，使之能更有效地編輯富含AT堿基的基因組[12]。

CRISPR-Cas9已被大量使用在植物基因功能分析及育種研究中[13-15]，其中包括多種果樹[14]。有關蘋果的幾項研究，依次是首次利用CRISPR-Cas9敲除內源 PDS （phytoene desaturase）基因[16]，高效傳送CRISPR-Cas9核糖核蛋白到蘋果原生質體操縱DIPM1（ DspA/E -interacting proteins of ?M.×domestica ）、DIPM2和DIPM4基因[17]，優化CRISPR-Cas9的應用條件并敲除PDS和TFL1（terminal flower）基因[3]，運用CRISPR-Cas9敲除DIPM4基因的同時又減少外源DNA的殘留[18]。相對地，CRISPR-Cpf1的技術特點更加鮮明，但在2016年首次應用于水稻和煙草后[19]，在植物基因組項目中使用的報道較少，目前還未見于果樹研究[2]。

已有的研究結果表明，CRISPR-Cas系統可實際應用于蘋果基因編輯，但只關注了少數幾個基因，且僅限于使用CRISPR-Cas9。本研究對蘋果全基因組序列進行初步分析，嘗試探索2種流行的CRISPR-Cas系統，即CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1，在蘋果基因組編輯中的整體適用性，首次從PAM的數量和頻率、靶序列的重復和分布及2種Cas蛋白的互補等幾個方面開展討論，并形成PAM位點和靶序列信息庫，以期為蘋果基因組編輯和CRISPR-Cas系統在蘋果研究中的推廣使用提供一定的參考和便利。

1 材料與方法

1.1 數據獲取

蘋果全基因組代表性數據ASM211411v1下載自NCBI網站[20]，17條染色體（chromosome，chr）和1條線粒體（mitochondrion，mt）的DNA序列以FASTA格式分別存儲在文本文件中;所有下載的DNA都只有單鏈（+）。相應的基因文件也從NCBI網站下載，其中以列表形式記錄基因在DNA序列上的起止位點等信息。最新發布在NCBI網站上的蘋果基因組數據ASM411538v1質量更高[21]，但相應的基因信息不夠完善，只在本研究中作對比和補充。在諸多CRISPR-Cas系統中，效應蛋白SpCas9[化膿性鏈球菌（ Streptococcus pyogenes ，Sp）]和FnCpf1[弗郎西斯菌（ Francisella novicida ，Fn）]識別的PAM較有代表性，分別為5′-NGG和5′-TTN[10-11];本研究圍繞這2種典型的PAM，嘗試使用個人計算機分析蘋果全基因組。

1.2 PAM計數和間距計算

對蘋果各DNA序列出現的5′-NGG或 5′-TTN 計數，并記錄中間堿基在DNA序列上的位點作為PAM位點;還需要同時累計5′-CCN或 5′-NAA，以實現對互補鏈的搜索。計數期間，單獨計算N所代表的各種堿基占比，并用PAM位點數量與DNA長度的比值表示序列的PAM密度。除線粒體外，合計染色體DNA的各項數據以考量全基因組。

同樣地，分別計算各DNA序列和全基因組的PAM出現頻率。將每2個相鄰PAM位點之差作為間距（用字母 d 表示），其意義為間隔 d 個堿基對存在1個PAM，代表PAM的出現頻率;并累計每個 d的出現次數（用字母n表示），再把全部d升序排列（以t為排列序號），記錄不同d的數量（用字母m 表示）。PAM出現頻率的均值（ d? mean）和中值（ d? median）計算如下：

d? mean=∑ mi=1d in i∑mi=1n i;若∑ti=1n i≥∑mi=1n i2>∑t-1i=1n i，d? median =d t 。

1.3 計算剪切位點

在DNA序列上從5′-NGG前溯3個堿基或從5′-CCN后推3個堿基，獲得Cas9剪切位點。通過判斷剪切位點是否處于基因的起止位點之間，將對應的PAM位點劃入相應的基因范疇;不屬于任何基因范疇的PAM位點不做標記。

依據Cpf1的剪切特征，在DNA序列上從5′-TTN后推18個堿基或從5′-NAA前溯23個堿基，獲得同向剪切位點，用來判斷相應的PAM位點是否屬于同向鏈基因;從5′-TTN后推23個堿基或從 5′-NAA 前溯18個堿基，獲得逆向剪切位點，用來判斷相應的PAM位點是否屬于互補鏈基因。

1.4 靶序列的截取

根據2種PAM的特點，在DNA序列上分別截取長度為20 nt（不含PAM）的靶序列（target），用PAM位點命名，以FASTA格式儲存;PAM在互補鏈上的，還需要按照堿基配對原則轉換堿基并逆序。對具有同種PAM的靶序列進行重復性搜索，找到單一序列（singleton）和相同序列簇（cluster）;簇中的PAM位點有屬于染色體基因的計1分，有屬于染色體基因間隔的計2分，有屬于線粒體基因的計4分，有屬于線粒體基因間隔的計8分，4種分值任意組合可將所有簇歸入15個重復類（用repeat ?N 命名， N 為不大于15的正整數）。重點關注靶序列單一且屬于基因范疇的PAM位點，其數量與基因長度的比值表示基因的可編輯度;按照“基因ID-PAM位點-靶序列”的模式建立簡易信息庫，找到可編輯度最高和最低的基因。

1.5 程序實現

以上操作已被整合到幾個Perl腳本中，并盡量優化算法降低時間復雜度和空間復雜度[22]。其中，為避免耗費大量時間，在判斷PAM位點是否影響基因時，用數組模擬DNA序列，數組索引表示位點，基因區間內的數組元素由基因ID填充，其他為未定義（undef）值;當剪切位點對應的數組元素為基因ID時，將PAM位點劃入此基因范疇。為避免占用大量內存空間導致程序卡頓，在搜索重復靶序列時，把總文件分割成大小合適的幾個子文件，使用散列快速剔除子文件內的相同序列;然后利用每個子文件中序列唯一的特點，使用散列剔除子文件間的相同序列，最終合并成沒有重復序列的總文件。

2 結果與分析

2.1 PAM含量分析

蘋果基因組（ASM211411v1）中5′-NGG總量為48 368 223，chr15的數量最多（4 179 083），chr01的最少（2 291 346），各染色體間差異較大;再結合序列長度估算序列的PAM密度，基因組是0.074，chr10最高（0.078），chr06最低（0.069），相差不大（表1）。在基因組中，CGG、GGG、AGG和TGG在NGG總量中的比例分別為11.9%、21.4%、30.4%、36.3%（圖1-A）;在各染色體中的比例與此一致，略有微小波動（表1）。線粒體中的5′-NGG含量為 46 468，但密度達到0.117，高于基因組最高值;CGG、GGG、AGG和TGG的比例分別為19.2%、259%、30.2%、24.7%，與基因組中的同項數據也有明顯差異（圖1-B）。

基因組中5′-TTN的總數為127 635 154，同樣是chr15最多（11 092 974），chr01最少（5 902 134）;估算基因組的密度是0.194，依然是chr10最高（0206），chr06最低（0.180），兩者比較接近（表2）。在基因組中，TTC、TTA、TTG和TTT在TTN總量中的比例分別為19.6%、21.2%、22.2%、37.0%（圖1-C）;同樣，在各染色體中的比例與此一致（表2）。線粒體中5′-TTN含量為69 296，密度只有0.174 6，低于基因組最低值;TTC、TTA、TTG和TTT的比例分別為28.4%、18.7%、20.7%、32.2%，與基因組中的同項數據也差異明顯（圖1-D）。

作為對比，另一基因組數據（ASM411538v1）的5′-NGG密度為0.084，CGG、GGG、AGG和TGG的比例分別為11.7%、21.5%、30.6%、36.3%;5′-TTN的密度為0.219，TTC、TTA、TTG和TTT的比例分別是19.6%、21.2%、22.4%、36.8%。使用2個不同版本的基因組數據計算出的結果很接近，特別是NGG和 TTN的構成比例幾乎完全一致，可以用同一組餅狀圖表示（圖1-A、圖1-C）。

2.2 PAM出現頻率

在蘋果基因組（ASM211411v1）中，相鄰5′-NGG的間距最小為1 bp，出現次數最多（圖2-A）;最大為1 347 bp，出現在chr07的19 065 740～19 067 087位點間（表1）。間距中值是7 bp，表示平均約間隔7 bp堿基就有1個5′-NGG，也說明半數以上的間距不大于7 bp;間距均值為12.0 bp，是受到最大值的影響而產生了偏移（圖2-a）。各染色體情況與此高度一致（表1）。而在線粒體中，間距中值和均值分別為5、8.5 bp，與基因組完全不同（圖2-b）。

基因組中，相鄰5′-TTN的間距最小為1 bp，出現次數最多（圖2-c）;最大為1 022 bp，出現在chr07的26 831 153～26 832 175位點間（表2）。間距中值是3 bp，表示平均約間隔3 bp堿基就有1個 5′-TTN，也說明半數以上的間距不大于3 bp;受最大值影響，間距均值是4.5 bp（圖2-c）。同樣，各染色體情況與此一致（表2）。線粒體的間距中值和均值分別為4、5.7 bp，也與基因組完全不同（圖2-d）。使用另一版本的基因組數據（ASM411538v1）計算，可得出類似的結果：5′-NGG的間距中值和均值分別為7、11.9 bp，5′-TTN的間距中值和均值分別為3、4.5 bp;所展示出的變化趨勢也可以繪成同樣的圖像（圖2-a、圖2-c）。

2.3 PAM的基因歸屬

在蘋果基因組中，29.0%的5′-NGG和26.9%的5′-TTN能影響到基因，基本覆蓋了全部43 464個基因（表3）。其中，chr06上ID為114825448的基因含5′-NGG最多，有14 620個;chr16的114822391（表示基因ID，下同）和chr09的114827208基因不含5′-NGG。chr06的114825448基因含5′-TTN最多，有36 069個;chr16的108169786、chr12的108174957、chr11的108174696、chr02的114823832、chr03的114824289和108171505基因都不含5′-TTN。

在線粒體中，15.6%的5′-NGG能作用于全部70個基因，13.5%的5′-TTN覆蓋了98.6%的基因（表3）。其中，ID為13630194的基因含5′-NGG最多，有1 186個;13630239（121 892～121 913位點）和13630229基因含5′-NGG最少，只有5個。13630194基因含5′-TTN最多，有1 337個;13630239基因（121 892～121 913位點）不含5′-TTN。與各染色體相比，線粒體中屬于基因間隔的PAM占比明顯更大（表3）。

2.4 靶序列的重復簇

蘋果的CRISPR靶序列有大量重復，共計15種重復簇（表4）。其中，重復序列只屬于染色體基因的簇劃入repeat1，只屬于染色體基因間隔的為repeat2，只屬于線粒體基因的為repeat4，只屬于線粒體基因間隔的為repeat8，repeat15是重復的靶序列同時出現在上述4個區域中。可以發現，帶有 5′-NGG 的靶序列，染色體基因的648條與線粒體基因中的620條重復;帶有5′-TTN的靶序列，染色體基因中的1 038條與線粒體基因中的966條重復（表4，repeat5、7、13、15）。只屬于染色體基因的，帶有5′-NGG的重復靶序列共有3 883 583條，帶有5′-TTN的重復靶序列共有84 71 496條（表4，repeat1、3、5、9、7、11、13、15括號中的數字）;而在線粒體基因中，這2個數值分別為980、1 087（表4，repeat4、5、6、12、7、13、14、15括號中的數字）。

2.5 基因可編輯度

在蘋果各染色體中，帶有5′-NGG的單一靶序列數量為26 778 571，其中屬于基因的有9 436 659，其余都處于基因間隔中;帶有5′-TTN的單一靶序列數量為73 337 956，屬于基因的有240 838 78（表4）。SpCas9對chr04上的103432805基因有最高的可編輯度，為0.226，含有PAM最多的114825448基因的可編輯度僅為0.020（圖3）;另有372個基因的可編輯度為0。FnCpf1對chr08上的114826681基因有最高的可編輯度，為0.344，含有PAM最多的114825448基因的可編輯度僅為0.049（圖3）;另有305個基因的可編輯度為0。

在線粒體中，帶有5′-NGG的單一靶序列數量為34 535，屬于基因的有4 344;帶有5′-TTN的單一靶序列數量為49 191，屬于基因的有5 220（表4）。SpCas9對13630239基因（121892～121913位點）可能有最高的可編輯度，為0.227，含有PAM最多的13630194基因的可編輯度為0.092（圖3）;有4個基因的可編輯度為0。FnCpf1對13630216基因可能有最高的可編輯度，為0.224，含有PAM最多的13630194基因的可編輯度為0.095（圖3）;有6個基因的可編輯度為0。

2.6 Cas蛋白的編輯互補

蘋果中的大多數基因可同時被2種Cas蛋白編輯， 分別具有不同的可編輯度搭配（圖3）。 可編輯度為0的基因在全部基因中的占比較小，在各DNA序列上均有分布;其中，chr04上的數量最多，有66個不能被SpCas9編輯、有62個基因不能被FnCpf1編輯（圖4）。經過篩選，共有237個（0.5%）染色體基因、2個（2.9%）線粒體基因能被1種Cas蛋白編輯，填補了另一種Cas蛋白留下的編輯空白（圖4，part Ⅰ、part Ⅲ）;共有220個染色體基因（0.5%）、4個（5.7%）線粒體基因不能被任一種Cas蛋白編輯，即2種Cas蛋白同時留下編輯空白，沒有互補（圖4，part Ⅱ）。

3 討論

作為重要的基因編輯工具[23]，CRISPR-Cas系統在蘋果基因組中有較好的整體適用性，主要表現在3個方面。一是有數量可觀的PAM分散在蘋果DNA序列的各個角落，出現頻率很高，平均間隔很短。二是Cas蛋白的作用位點幾乎覆蓋了所有基因，個別不能被SpCas9識別的基因卻含有FnCpf1的識別位點，反之亦然。三是擁有單一靶序列的基因占大多數，99.5%的染色體基因和94.3%的線粒體基因都能至少被其中1種Cas蛋白編輯。蘋果DNA序列的測序結果表明，AT堿基的含量高于CG堿基[20-21]，導致5′-TTN的數量遠超5′-NGG、5′-TTN 的出現頻率更高、帶有5′-TTN的單一靶序列數量更多，也就是說Cpf1在蘋果基因編輯中有更大的可挖掘潛力。

各染色體的PAM密度、組成和出現頻率幾乎一致，可視作蘋果基因組的整體特征之一。雖然也存在于蘋果細胞中，但線粒體通常被認為是有益的共生生物[24]，其DNA不被計入基因組;這一點在本研究中也有突出體現，即與染色體的同項數據相比，線粒體都有明顯差異。目前，對蘋果線粒體基因的編輯還未見報道，其操作過程是否與基因組相同還需要更深入的研究驗證，在本研究中僅是預測性的初步探討;且線粒體DNA體量小、基因少[20]，對基因組編輯的影響不大，在特定環境中可不做考慮。葉綠體也有類似情況[25]，可在條件成熟時進一步研究討論。

已有的測序結果含有未知堿基，在數億堿基的蘋果DNA序列中比例微小，對多項計算結果的影響可忽略不計[20-21]。但如果2個PAM之間存在未知堿基且結合上下游無法判斷是否存在另一個PAM，就在確定PAM頻率時摒棄這2個PAM的間距，避免出現超長間距的同時，也保證了是在計算相鄰2個PAM的間距。對比人類基因組取間距中值作為PAM的出現頻率，本研究也采用了同樣的取值方法;蘋果基因組平均間隔7 bp堿基就有1個5′-NGG，頻率高于人類基因組的8 bp[10]。

一般，判斷PAM是否屬于基因依據的是其位點是否在基因起止位點間，臨近基因邊緣的PAM就有可能實際作用到了間隔區。不同于此，本研究將判斷依據改進為剪切位點是否在基因起止位點間，既避免了上述問題，也充分挖掘了隱藏的基因PAM。在此基礎上截取的靶序列都具有明確的基因歸屬。靶序列的長度按常規被設定為20 nt，初步分析了因序列重復導致的脫靶情況;根據序列越短重復率越高的共識，可適當增加靶序列的長度提高基因的可編輯度。此外，脫靶的原因還包括相似匹配和種子序列的長度[11]，可在未來的研究中做更深入的分析。

基因可編輯度與單一靶序列的數量成正比，與基因自身的長度成反比，表示的是單位長度內含有的備選靶序列密度。可編輯度為0的基因，小部分是因為不含有PAM，大多數是在屏蔽了重復靶序列后，備選數量為0。本研究采用了較嚴格的屏蔽標準，凡是在蘋果DNA序列中出現的重復靶序列均計入重復簇;重復簇的類別劃分較細，15個類別涵蓋了靶序列所在4個區域的所有搭配，方便在試驗設計時有側重地取舍。在蘋果全部基因中，2種Cas蛋白都有占比很小的編輯盲區，FnCpf1要好于SpCas9。盲區重疊的部分所含的224個基因不適宜使用這2種Cas蛋白編輯，可考慮換用識別不同PAM的其他Cas蛋白;其中超過半數的基因（139個）編碼多種RNA，通常在實際研究中較少涉及到。

在Perl腳本的幫助下，各步驟的運算結果都在文本文件中詳細列表構成了信息庫，可直接打開查詢感興趣的信息;也可導入數據庫加以專業化的管理和維護，成為網絡服務平臺的構建基礎，這是開展下一步研究的一個重要方向。

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