呼吸道合胞病毒與肺炎衣原體感染肺炎患兒的外周血淋巴細(xì)胞亞群特征比較

曾瑞梅 吳亞平

肺炎是兒童較常發(fā)生的一種呼吸道感染性疾病，具有發(fā)病迅速、易感染等特點(diǎn)，約有10%的患兒可進(jìn)展為重癥肺炎，是7歲以下兒童死亡的一個(gè)主要病因［1］。細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體感染均可能引起小兒肺炎，不同病原體感染誘發(fā)的免疫發(fā)展方向可能存在較大差異，采取的治療措施也不同，但患兒早期臨床表現(xiàn)可能無明顯特異性，僅根據(jù)臨床表現(xiàn)并不能明確病原體類型，增加了臨床對癥治療難度，影響治療效果［2］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）與肺炎衣原體（chlamydia pneumoniae，CP）感染是引起小兒肺炎的常見原因，發(fā)病率高但患兒死亡率較低［3］。目前，臨床關(guān)于細(xì)菌性肺炎、支原體肺炎及多種病毒性肺炎的研究較多，但關(guān)于RSV和CP感染小兒肺炎的免疫影響比較鮮有報(bào)道。因?yàn)槊庖咧委熌軌蛴行Ы档蚏SV、CP引發(fā)的呼吸道感染發(fā)病率，了解RSV和CP感染所致肺炎患兒的外周血淋巴細(xì)胞亞群特征，分析兩種病原體的免疫反應(yīng)作用機(jī)制，對于發(fā)展靶向免疫治療有著積極意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月至2020年12月桐廬縣第一人民醫(yī)院收治的肺炎患兒1,000例。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤12歲；符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》［4］中的小兒肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，有呼吸道感染病史、呼吸道感染癥狀及體征；胸部X線片可見肺炎影像；病原體檢測明確為單一病原體感染，RSV或CP；無其他系統(tǒng)器官感染。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：吸入性肺炎、先天性疾病及濕肺；混合感染；近3個(gè)月接受過抗感染治療者；臨床資料不完整。其中，男童584例，女童416例；年齡0.25～11（6.58±4.05）歲；入院時(shí)均有發(fā)熱（≥38.5 ℃）、咳嗽、流涕等癥狀；RSV感染496例（急性感染299例、慢性感染197例），CP感染504例（急性感染328例、慢性感染176例），病程≤1個(gè)月為急性感染，病程＞1個(gè)月為慢性感染。另選取同期在本院進(jìn)行健康體檢兒童（性別、年齡相匹配）100例作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 （1）在病程第3～5天采集患兒外周靜脈血3 mL，對照組兒童在體檢時(shí)采集靜脈血標(biāo)本，以3,000 r/min離心10 min，分離血清后使用抗凝真空管保存2份，置于-70 ℃的冰箱中待檢。（2）一份血清標(biāo)本使用CANTO Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）及淋巴細(xì)胞亞群試劑盒測定T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞各表型的百分比，T淋巴細(xì)胞表型包括CD3+、CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+，計(jì)算CD4+/CD8+，B淋巴細(xì)胞包括CD3-CD19+，自然殺傷細(xì)胞為CD3-CD56/16+。采用比例計(jì)算淋巴細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)，計(jì)算公式：總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)×某表型淋巴細(xì)胞百分比。（3）另一份血清采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定血清轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平，試劑盒均由R&D公司提供，操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，在450 nm酶標(biāo)儀下讀取吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平。

1.3 觀察指標(biāo) （1）三組兒童的外周血淋巴細(xì)胞亞群（T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞）絕對計(jì)數(shù)；（2）三組兒童的血清TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平；（3）急性感染及慢性感染患兒的細(xì)胞因子水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)/百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用方差分析或t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布以 ［M（P25，P75）］表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組的一般資料比較 三組兒童的性別、年齡、感染程度、感染史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 RSV感染、CP感染患兒與健康兒童的一般資料比較

2.2 三組的外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)比較 三組的外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3-CD19+絕對計(jì)數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三組的CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD56/16+絕對計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），組內(nèi)兩兩比較顯示對照組的CD4+/CD8+絕對計(jì)數(shù)明顯低于RSV組和CP組（P＜0.05），RSV組的CD3+CD4+、CD4+/CD8+絕對計(jì)數(shù)均比CP組更高，CD3-CD56/16+比CP組更低（P＜0.05），CP組的CD3+CD4+絕對計(jì)數(shù)與對照組接近（P＞0.05），CD3-CD56/16+高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 三組的外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)比較［M（P25，P75）］

2.3 三組的血清細(xì)胞因子水平比較 三組的血清細(xì)胞因子水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組內(nèi)兩兩比較顯示，對照組的TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平均低于另外兩組（P＜0.05），RSV組與CP組的血清TGF-β1水平接近（P＞0.05）。RSV組的血清IL-17、IL-10水平比CP組更高，IFN-γ水平比CP組更低（P＜0.05）。見表3。

表3 三組的血清細(xì)胞因子水平比較［pg/mL，（±s）］

表3 三組的血清細(xì)胞因子水平比較［pg/mL，（±s）］

組別 n TGF-β1 IL-17 IFN-γ IL-10 RSV組 496 63.84±12.01 103.95±33.57 66.25±7.69 68.97±10.84 CP組 504 61.78±9.28 55.24±32.96 112.47±25.58 23.55±6.32對照組 100 30.36±8.69 23.05±13.25 36.77±10.27 16.02±5.27 F值 7.036 13.628 23.658 10.996 P值 0.037 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 急慢性感染患兒的血清細(xì)胞因子水平比較 RSV組和CP組急性感染患兒的血清TGF-β1、IL-17、IL-10、IFN-γ水平均高于慢性感染患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 急慢性感染患兒的血清細(xì)胞因子水平比較［pg/mL，（±s）］

表4 急慢性感染患兒的血清細(xì)胞因子水平比較［pg/mL，（±s）］

組別 n TGF-β1 IL-17 IFN-γ IL-10 RSV組 急性 299 74.78±11.95 127.69±23.45 70.36±7.26 75.84±9.22慢性 197 50.21±13.66 85.29±24.64 40.25±6.32 55.21±9.76 t值 13.658 24.669 16.928 20.958 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 CP組 急性 328 66.57±8.42 63.28±18.49 133.54±26.69 31.48±7.25慢性 176 50.04±9.17 48.04±15.97 101.52±24.48 18.27±5.93 t值 16.669 18.054 12.908 9.962 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

RSV和CP是小兒呼吸道感染的主要病原體。RSV是一種單鏈RNA病毒，其在感染季節(jié)內(nèi)及感染季節(jié)之間可以發(fā)生廣泛變異，能引起患兒不同程度的肺部感染，病情嚴(yán)重時(shí)可造成毛細(xì)支氣管炎，部分患兒還可能進(jìn)展為長期慢性氣道疾病［5］。雖然最初的RSV僅在鼻咽內(nèi)復(fù)制，但其可逐步傳播至下呼吸道引發(fā)下呼吸道感染。RSV被證實(shí)對Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞均有嗜性，能通過感染肺泡上皮細(xì)胞來影響氣體交換及肺泡表面活性劑的產(chǎn)生［6］。RSV糖蛋白能夠輔助RSV進(jìn)入細(xì)胞，抑制核因子-κb的激活，調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，協(xié)助病毒逃離中和抗體。臨床認(rèn)為RSV感染引起的肺部疾病嚴(yán)重程度與機(jī)體抗病毒T細(xì)胞反應(yīng)密切相關(guān)［7］。CP是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，是人類常見的呼吸道致病菌，常引起鼻竇炎、咽炎、肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘等急性呼吸道感染。另有研究指出，CP的持續(xù)性感染還可能增加動脈硬化、急性心肌梗死、盆腔炎等疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［8］。國外的一項(xiàng)調(diào)研結(jié)果顯示，CP在社區(qū)獲得性肺炎病因中排名第二［9］。

研究顯示，CP感染可引起以細(xì)胞免疫為主的免疫應(yīng)答，機(jī)體免疫系統(tǒng)主要通過各種免疫應(yīng)答反應(yīng)來對病原體的侵襲進(jìn)行防御，其中體液免疫利用血清抗體發(fā)揮防御作用，細(xì)胞免疫則能有效清除病原體。各種免疫應(yīng)答途徑會讓機(jī)體的淋巴細(xì)胞亞群呈現(xiàn)不同變化，而兒童對感染的免疫反應(yīng)通常要比成人更為活躍。在機(jī)體受到病原體侵襲時(shí)，T細(xì)胞會收到來自于抗原提呈細(xì)胞呈遞的外源性抗原肽，T淋巴細(xì)胞被激活后，CD4+T淋巴細(xì)胞會促進(jìn)T細(xì)胞向效應(yīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并釋放活性物質(zhì)增加B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，進(jìn)而引發(fā)免疫損傷［10］。CD8+T細(xì)胞活化后會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，其在脫顆粒作用下釋放顆粒酶B、穿孔素，從而對靶細(xì)胞造成損傷。本研究顯示，RSV組和CP組的CD4+/CD8+絕對計(jì)數(shù)較健康對照組增高，表明不論是RSV感染還是CP感染均會引起不同程度的免疫功能紊亂，具體表現(xiàn)為CD8+T細(xì)胞減少。本研究中RSV感染與CP感染患兒比較，RSV組的外周血CD3+CD4+、CD4+/CD8+絕對計(jì)數(shù)更高，CD3-CD56/16+百分比更低。有研究指出，不論病原體是病毒還是細(xì)菌，均會造成外周血CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞減少，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞升高［11］，因?yàn)榛純旱姆尾渴艿讲≡w感染后發(fā)生免疫功能失調(diào)，機(jī)體對抗原的殺傷力減弱，體液免疫水平下調(diào)，所以不能有效地將病原菌清除體外。RSV與CP感染引起的外周血淋巴細(xì)胞亞群變化存在差異，與國內(nèi)相關(guān)報(bào)道結(jié)論有類似之處［12］。本研究結(jié)果顯示，相較于RSV感染，CP組NK細(xì)胞百分比更高。NK細(xì)胞參與機(jī)體的固有免疫，會對病原體和被感染細(xì)胞產(chǎn)生直接的殺傷作用，并且還能通過促進(jìn)IFN-γ的分泌來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，NK細(xì)胞減少可造成IFN-γ分泌減少，造成Th1/Th2免疫失衡。進(jìn)一步的血清細(xì)胞因子檢測發(fā)現(xiàn)，CP組的血清IFN-γ水平高于RSV組，可能是因?yàn)镃P是一種細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，感染單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞引發(fā)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞增殖、IFN-γ分泌。研究證實(shí)，CP感染能夠減少繼發(fā)感染，因?yàn)樵撁庖哌^程是由CD4+T細(xì)胞反應(yīng)所介導(dǎo)，而CD4+T細(xì)胞識別的抗原能夠在隨后的感染中發(fā)揮保護(hù)作用［13］。IL-10為抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)的嗜性細(xì)胞因子，幾乎所有免疫細(xì)胞都能表達(dá)IL-10的兩個(gè)亞單位，但主要由CD4+T細(xì)胞表達(dá)，故免疫細(xì)胞較易受到IL-10的抑制作用。臨床認(rèn)為RSV引起的肺部疾病與宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)RSV組的CD4+T細(xì)胞百分比、血清IL-10水平均高于CP組，與國外報(bào)道結(jié)論相符［14］，表明RSV感染引起的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)更為強(qiáng)烈，調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)使得IL-10分泌增加，IL-10可對T細(xì)胞介導(dǎo)的肺部炎癥及損傷發(fā)揮抑制作用，其在調(diào)節(jié)RSV的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

特異性的CD4+T細(xì)胞能夠識別CP抗原，主要利用CD4+細(xì)胞分泌的IFN-γ對CP抗原發(fā)揮溶解作用，Th2細(xì)胞無法控制CP感染一方面與IFN-γ的缺乏有關(guān)，另一方面則與Th2細(xì)胞無法攻擊受感染細(xì)胞有關(guān)。CP感染引起的免疫反應(yīng)以Th2反應(yīng)為主導(dǎo)，而IFN-γ、IL-10等細(xì)胞因子均參與Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)。本研究通過比較不同感染程度患兒的血清細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，急性感染者的血清TGF-β1、IL-17、IL-10、IFN-γ水平明顯更高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論相符［15］，說明不論是RSV還是PC感染引起的小兒肺炎，急性發(fā)病引起的適應(yīng)性免疫反應(yīng)更為明顯，并且這種免疫反應(yīng)會隨著時(shí)間的推移而減弱。

綜上所述，RSV和CP感染引起的外周血淋巴細(xì)胞亞群變化存在一定差異，二者分別主要通過調(diào)節(jié)IL-10和IFN-γ表達(dá)來影響CD4+T細(xì)胞亞群，引起細(xì)胞免疫異常，通過檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)血清細(xì)胞因子可為臨床判定小兒肺炎感染類型提供一定依據(jù)。