HPLC法測(cè)定康骨寧顆粒中橙皮苷的含量*

唐莉華 黃學(xué)娣 熊 躍 黃 寬 李 凡

在外力作用下，破壞了骨或軟骨的完整性和連續(xù)性者，稱為骨折，屬于中醫(yī)“骨傷”范疇。由于外因(直接外力、間接外力、撕脫暴力、累積性力)和內(nèi)因(解剖結(jié)構(gòu)、年齡、病理因素、職業(yè)因素)等病因，可造成開(kāi)放性和閉合性骨折。臨床主要癥狀為局部疼痛、腫脹和功能障礙(握持、站立、行走等功能的喪失)[1]。清代沈金鰲在《雜病源流犀燭》中指出：“凡人忽跌忽閃挫，必氣為之震，震則激，激則壅，壅則氣凝聚一處……氣運(yùn)乎血，血本隨氣以周流，氣凝則血亦凝矣……氣滯血瘀，則作腫作痛，諸變百出……故跌撲閃挫，其傷在外而病必及內(nèi)，其氣必壅，其血必凝……為之行氣，為之行血，不得徒從外涂抹之已也……輕者，頓挫氣血，凝滯作痛，當(dāng)導(dǎo)氣行血而已。若重者，傷筋折骨，必須接續(xù)”[2]。康骨寧顆粒由龍血竭、當(dāng)歸、川芎、陳皮、生地黃、赤芍、乳香、沒(méi)藥、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)等中藥組方而成，具有活血祛瘀、行氣止痛、消腫生肌、接骨續(xù)筋等作用[3-5]。此成藥方由江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科謝水華主任醫(yī)師根據(jù)沈金鰲的“接骨紫金丹”(載于《雜病源流犀燭》)，結(jié)合自身多年臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而成，在治療四肢骨折疾病方面，具有獨(dú)特的療效。在保證療效的前提下，該藥已經(jīng)進(jìn)行了制劑工藝的研究，但還未建立指標(biāo)性成分的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。為了彌補(bǔ)康骨寧顆粒的不足之處，此研究參考《中華人民共和國(guó)藥典》[6]與文獻(xiàn)研究[7，8]中關(guān)于橙皮苷含量測(cè)定的方法，應(yīng)用HPLC法測(cè)定康骨寧顆粒中橙皮苷的含量，為制定康骨寧顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以保障臨床應(yīng)用的安全性、有效性和制劑的質(zhì)量可控性，從而進(jìn)一步提高臨床的療效及治愈率。

1 材料

1.1 儀器高效液相色譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器(Agilent 1260)；電子分析天平(ESJ182-4，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)；恒溫干燥箱(202-2-S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；超聲波清洗機(jī)(KQ2200B，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑康骨寧顆粒(批號(hào)：20200701-20200710，自制)，對(duì)照品橙皮苷(批號(hào)：110721-202019，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，乙腈為色譜純?cè)噭?賽諾菲世爾科技(中國(guó))有限公司)，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：安捷倫C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以水(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3)為流動(dòng)相B，按照表1程序進(jìn)行梯度洗脫。流速：1.0 ml·min-1，柱溫：30 ℃ ，檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；進(jìn)樣量：10 μl，理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入80%甲醇(體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液，以下相同)溶解，并稀釋制成每1 ml含橙皮苷25 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取康骨寧顆粒適量，研細(xì)(過(guò)4號(hào)篩)并混勻，取約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中。精密加入25 ml的80%甲醇溶液，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率300 W，頻率40 kHz)，取出后放冷，再稱定重量。用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻并濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備按康骨寧顆粒原處方比例稱取缺陳皮的中藥飲片，按照其制劑工藝制備陰性樣品，再按照“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液以及缺陳皮陰性對(duì)照溶液各10 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液色譜(圖1B)中與對(duì)照品色譜(圖1A)中在相同的保留時(shí)間(橙皮苷保留時(shí)間約10 min)有對(duì)應(yīng)的色譜峰，理論塔板數(shù)符合要求，并與其他各峰達(dá)到基線分離，陰性樣品色譜(圖1C)中在相同保留時(shí)間(10 min)無(wú)對(duì)應(yīng)的色譜峰。表明本方法專屬性良好，陰性對(duì)照色譜不干擾測(cè)定。

注：橙皮苷對(duì)照品(A)、康骨寧顆粒供試品(B)和缺陳皮陰性樣品(C)。圖1 色譜圖

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取對(duì)照品溶液(橙皮苷濃度為26.13 μg·ml-1)2 μl、5 μl、8 μl、10 μl、15 μl、20 μl注入高效液相色譜儀中，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。并以橙皮苷的進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.9148X+4.5012，R=0.9998。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，橙皮苷的進(jìn)樣量在52.26～522.60 ng范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6.2 精密度試驗(yàn)精密吸取橙皮苷的對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，并記錄峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，儀器的精密度良好，能滿足含量測(cè)定的要求。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)取康骨寧顆粒(批號(hào)：20200701)6份，每份約1 g，按照“2.3”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算橙皮苷平均含量為0.64 mg/g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，該測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取康骨寧顆粒(批號(hào)：20200701)約1 g，按照“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，于室溫放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h時(shí)，精密各吸取10 μl供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.67%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，供試品溶液在室溫條件下放置24 h以內(nèi)，其穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn)取康骨寧顆粒(批號(hào)：20200701，每1 g含橙皮苷0.64 mg)6份，精密各稱定0.50 g，分別加入橙皮苷對(duì)照品溶液1 ml(每1 ml含橙皮苷0.3179 mg)，按照“2.3”項(xiàng)下的制備方法，制成加樣回收樣品溶液，再按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率的平均值為100.28%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品的測(cè)定取10批康骨寧顆粒各約1 g，按照“2.3”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，再按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算康骨寧顆粒中橙皮苷的平均含量為8.24 mg/袋。見(jiàn)表3。

表3 康骨寧顆粒中橙皮苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇康骨寧顆粒由13味中藥組成，君藥龍血竭來(lái)源于百合科喬木植物劍葉龍血樹(shù)(Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen)的含脂木材經(jīng)提取得到的樹(shù)脂，具有良好的活血散瘀、定痛止血和斂瘡生肌的作用[9]，素有“活血之圣藥”的美譽(yù)。現(xiàn)代藥理研究[10,11]顯示龍血竭能明顯縮短小鼠凝血時(shí)間和家兔血漿復(fù)鈣時(shí)間，廣泛應(yīng)用于跌打損傷、外傷出血等，可作為血竭的國(guó)產(chǎn)替代品。多省市頒布的中藥飲片炮制規(guī)范[9,12，13]中以龍血素B作為含量測(cè)定的成分，均使用三氯甲烷(非極性溶劑)作為成分提取溶劑。通過(guò)查閱相關(guān)研究資料[10，14-16]，僅對(duì)龍血竭的脂溶性成分(黃酮類、木質(zhì)素、皂苷類、甾醇類、酚類等)有相關(guān)研究。結(jié)合康骨寧顆粒的制備工藝，龍血竭脂溶性成分不適宜作為康骨寧顆粒的指標(biāo)性成分。臣藥當(dāng)歸中的水溶性阿魏酸與佐藥川芎的阿魏酸經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，存在陰性干擾。筆者對(duì)處方中其他藥材進(jìn)行了研究，參考《中華人民共和國(guó)藥典》[6]和文獻(xiàn)報(bào)道[17]選擇了行氣藥陳皮中橙皮苷為指標(biāo)性成分，建立了橙皮苷的含量測(cè)定方法。

3.2 樣品提取方法的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17，18]、橙皮苷的溶解性以及康骨寧顆粒的制備工藝等因素，對(duì)樣品中指標(biāo)性成分橙皮苷提取溶劑的濃度(50%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇)、用量(25 ml、50 ml、75 ml、100 ml)和超聲提取時(shí)間(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h)進(jìn)行了考察與擇優(yōu)選擇。最終確定采用80%乙醇溶液25 ml進(jìn)行提取，超聲處理30 min為提取的條件。應(yīng)用該方法處理后的樣品，橙皮苷成分提取完全、提取率高，溶劑的用量處于最優(yōu)化，室溫下含橙皮苷的供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3 橙皮苷含量限定的確定據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》[6]陳皮項(xiàng)下規(guī)定：水分不得過(guò)13.0%，干燥品含橙皮苷(C28H34O15)不得少于2.5%。康骨寧顆粒每袋中含有陳皮為1.44 g，在充分考慮大生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的藥材損耗等因素，橙皮苷的轉(zhuǎn)移率以12%為標(biāo)準(zhǔn)(制劑工藝研究橙皮苷轉(zhuǎn)移率為15%)，得出本品每袋含橙皮苷為3.76 mg。故擬將康骨寧顆粒的含量限度定為：每袋含陳皮的劑量，以橙皮苷(C28H34O15)計(jì)，不得少于3.8 mg。

此試驗(yàn)以橙皮苷為指標(biāo)性成分，利用HPLC法測(cè)定陳皮中橙皮苷的含量測(cè)定，并初步設(shè)定含量限定的標(biāo)準(zhǔn)。該方法樣品制備方法簡(jiǎn)便，測(cè)量方法專屬性好，陰性無(wú)干擾，定量分析方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度良好，可有效地控制該藥品的內(nèi)在質(zhì)量，為康骨寧顆粒的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)依據(jù)。