ID-UPLC-MS/MS檢測大鼠尿液DNA氧化標(biāo)志物8-oxodGuo方法的建立*

黃 斌，趙素玉，林董莉，吳瓊碧，吳仙軍，張 偉，葉玲燕，梅益斌

(浙江省麗水市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 323000)

氧化應(yīng)激最早源于對衰老的認(rèn)識，因自由基傷害并不是造成老化的唯一因素，所以在1990年美國衰老研究權(quán)威專家Sohal教授指出了自由基存在的缺陷，并首次提出了氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是指高活性分子如活性氧(reactive oxygen species,ROS)等誘導(dǎo)復(fù)雜反應(yīng)體系中重要生物分子發(fā)生氧化修飾，當(dāng)不斷產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物超出了機(jī)體的清除能力，就會使得氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，最終導(dǎo)致組織損傷。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的ROS、自由基等可引起許多生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化損傷，而核酸的氧化損傷相對來說較為重要。核酸的氧化損傷可分為直接氧化損傷和間接氧化損傷，直接氧化損傷是核酸上的堿基發(fā)生氧化，間接的氧化損傷是指核苷酸池中的原始核苷酸上堿基發(fā)生氧化損傷[1]。

每個細(xì)胞正常代謝所產(chǎn)生的ROS、自由基每天可修飾大約10 000個堿基，AMES等[2]認(rèn)為即使生物體具備完善的氧化修復(fù)機(jī)制，也會有少量損傷的堿基因為得不到充分修復(fù)而發(fā)生損傷積累。脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)氧化損傷與多種疾病密切相關(guān)，如慢性肝炎[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、青光眼[5-6]、慢性阻塞性肺病[7]、甲狀腺疾病[8]、冠心病[9-11]、房顫[12]等，而DNA氧化損傷多種產(chǎn)物中，8-羥基脫氧鳥苷(8-oxo-7,8-dihydro-2-deoxyguanosine，8-oxodGuo)是國際公認(rèn)的DNA氧化損傷敏感的生物標(biāo)志物。

相較于酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、高效液相色譜電化學(xué)檢測(high performance liquid chromatography electrochemical detectors，HPLC-ECD)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)方法，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)檢測方法因其分離快速、檢測靈敏度高等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于DNA氧化損傷產(chǎn)物的檢測。但已建立的尿液8-oxodGuo UPLC-MS/MS檢測方法[13-14]，樣本處理流程煩瑣，應(yīng)用固相萃取柱費用昂貴，檢測時間也較長，本研究引入了同位素內(nèi)標(biāo)，建立了一種干擾小，靈敏度高，線性佳，分析快速、準(zhǔn)確的UPLC-MS/MS檢測方法(ID-UPLC-MS/MS)，可較好地應(yīng)用于評價氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的DNA氧化損傷。

1 材料與方法

1.1 試劑

8-oxodGuo(純度大于98%)購于美國Sigma-Aldrich 公司；[15N5]8-oxodGuo(純度大于98%)購于美國Cambridge Isotope Laboratories 公司；甲酸(HPLC級)購于德國Merck公司；醋酸銨、甲醇(HPLC級)購于美國Fisher Scientific公司。蒸餾水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器

質(zhì)譜儀：Agilent 6490 Triple Quad MS/MS 三重四極桿質(zhì)譜儀；超高效液相：Agilent UPLC 1290 超高效液相系統(tǒng)；色譜柱：SB-Aq,3.0 mm×100.0 mm,1.8 μm,600 Bar，以上均為美國Agilent公司產(chǎn)品； -80 ℃超低溫冰箱 (日本Revco公司)；MilliQ Plus 超純水機(jī) (美國Milliporegong公司)；520A 型pH 計 (美國Orion公司)；120S型電子分析天平(德國Sartorius公司)；Beckman 22R型臺式低溫高速離心機(jī)(美國Beckman-Coulter公司)。

1.3 溶液配制

(1)配置10 mol/L醋酸銨：稱38.5g醋酸銨溶于50 mL屈臣氏蒸餾水中，混勻；(2)配制10 mmol/L的醋酸銨：取10 mol/L醋酸銨1 mL用屈臣氏蒸餾水稀釋到1 L，混勻，再調(diào)pH=3.7；(3)配制5 mmol/L的醋酸銨(含0.1%甲酸)：取10 mol/L醋酸銨0.5 mL用屈臣氏蒸餾水稀釋到1 L，再加入甲酸1 mL，混勻；(4)工作液：用10 mmol/L的醋酸銨(pH=3.7)配制30%的甲醇溶液。

1.4 液相及質(zhì)譜條件

(1) 液相條件:水相(A)為5 mmol/L的醋酸銨(含0.1%甲酸，pH=3.7)，有機(jī)相(B)為甲醇；平衡時間1 min；進(jìn)樣體積5 μL；針位0 mm；柱溫箱溫度35 ℃；梯度洗脫條件見表1。(2) 質(zhì)譜條件：離子源為Jet Stream ESI源；離子掃描模式為動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描模式(Dynamic MRM)；干燥氣溫度為200 ℃；干燥氣流量為16 L/min；霧化氣壓力為30 psi；鞘氣溫度為400 ℃；鞘氣流量12 L/min；毛細(xì)管電壓2 000 V；噴嘴電壓0 V；具體離子對信息見表2。

表1 尿液8-oxodGuo液相梯度洗脫

表2 目標(biāo)化合物離子對參數(shù)

1.5 樣本收集

SD大鼠購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)SPF級動物房中，溫度可控、12 h晝夜交替。動物可自由飲水及進(jìn)食，全部實驗操作依照國家衛(wèi)生研究院實驗動物保護(hù)及使用指南執(zhí)行。將3月齡大鼠放置于代謝籠中，收集24 h尿樣，經(jīng)過8 000×g 3 min離心后，分裝于1.5 mL高壓滅菌離心管中，并儲存于-80 ℃直至被分析。

1.6 樣品處理

取200 μL大鼠尿液置于 1.5 mL 高壓滅菌離心管中，加入200 μL工作液，再加入480 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)和屈臣氏蒸餾水各10 μL，渦旋儀上渦旋混勻2 min，后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱10 min，再于4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清液100 μL加入到進(jìn)樣瓶內(nèi)的一次性內(nèi)插管中，UPLC-MS/MS進(jìn)樣5 μL直接檢測或-80 ℃凍存待測。

2 結(jié) 果

2.1 實驗溶劑及流動相質(zhì)譜全掃圖

為防止實驗溶劑及流動相對檢測結(jié)果造成影響，本研究對所用實驗溶劑和流動相進(jìn)行了質(zhì)譜全掃，見圖1。由圖1可見屈臣氏蒸餾水，流動相水相5 mmol的醋酸銨(含0.1%甲酸，pH 3.7)及有機(jī)溶劑甲醇(含0.1%甲酸)對8-oxodGuo的質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio，m/z)分別為284/168和284/140，其對[15N5]8-oxodGuo的m/z 289/173的影響可忽略不計。

A：屈臣氏蒸餾水；B：流動相水相；C：甲醇(含0.1%甲酸)。

2.2 DNA氧化損傷標(biāo)志物8-oxodGuo的色譜圖

8-oxodGuo及其內(nèi)標(biāo)的出峰時間在第3.75 min，為減少背景噪音對分析物的影響，故大致將2.5 min前及4.0 min后洗脫出的非目標(biāo)分析物直接排入廢液，只分析2.5～4.0 min間洗脫出的8-oxodGuo及其內(nèi)標(biāo)。8-oxodGuo及其同位素內(nèi)標(biāo)峰形對稱，出峰位置干擾少，見圖2。

2.3 檢測方法的評價

2.3.1線性關(guān)系

本文所建立的ID-UPLC-MS/MS檢測方法的最低檢測限為0.2 pg(信噪比=10)，在0.4～100.0 ng/mL線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.051 3X-0.022 4，相關(guān)系數(shù)為r=0.999 6。X為檢測物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積，Y為檢測物濃度。

2.3.2回收率和精密度

通過在已知8-oxodGuo濃度的大鼠尿液100 μL中分別加入低、中、高3種不同濃度(0.4、10、100 ng/mL)的 8-oxodGuo標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，經(jīng)過樣本處理流程及ID-UPLC-MS/MS檢測，所得的回收率及精密度見表3。

2.4 大鼠尿液樣本DNA氧化損傷標(biāo)志物8-oxodGuo水平

3月齡大鼠尿液中DNA氧化損傷產(chǎn)物8-oxodGuo的濃度在4.88～6.66 ng/mL范圍內(nèi)檢測的5只大鼠尿液8-oxodGuo濃度分別為5.36、4.88、6.66、6.51、5.93 ng/mL。

A：樣本；B：標(biāo)準(zhǔn)品(10 ng/mL)；C：樣本+標(biāo)準(zhǔn)品(2 ng/mL)。

表3 8-oxodGuo低、中、高濃度回收率及精密度

3 討 論

當(dāng)前， ELISA[15-16]、HPLC-ECD[17-18]，GC-MS[19-20]和LC-MS[21-25]已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于DNA氧化鳥苷的檢測。然而ELISA常常存在較大的背景干擾和非特異性染色，HPLC-ECD對ECD要求相對較高，GC-MS在氣化過程中可能有較嚴(yán)重的自動氧化，LC-MS相對分離時間較長。已建立的尿液8-oxodGuo UPLC-MS/MS檢測方法[13-14]，樣本處理流程相對煩瑣，應(yīng)用固相萃取柱費用昂貴，檢測時間也較長，而本研究建立的ID-UPLC-MS/MS檢測方法干擾小，靈敏度高，線性佳，分析快速、準(zhǔn)確，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。

本研究建立ID-UPLC-MS/MS檢測方法使用甲醇作為流動相的有機(jī)相，雖然甲醇的洗脫能力較乙腈弱，但對8-oxodGuo的響應(yīng)比乙腈快，這可能與甲醇的離子化能力較強(qiáng)相關(guān)，而且尿樣相對較臟，受干擾也較大，若響應(yīng)不夠快，則檢測結(jié)果將有所損失。若尿液前期處理方法不適當(dāng)， 8-oxodGuo的檢測結(jié)果將受影響，同時低濃度的回收率波動較大，標(biāo)準(zhǔn)偏差值也相對較大，因此在絕對進(jìn)樣量相同情況下，低濃度大進(jìn)樣體積的結(jié)果不如高濃度低進(jìn)樣體積的結(jié)果穩(wěn)定。雖然當(dāng)前研究樣本處理流程相對簡單，但相較于用純甲醇、純乙腈、與甲醇或乙腈不同比例混合的10 mmol/L的醋酸銨混合液進(jìn)行的樣本處理比較，本研究的處理方法8-oxodGuo響應(yīng)相對較快。

當(dāng)前多項研究證實DNA氧化在多種疾病如職業(yè)暴露疾病、糖尿病腎病、腫瘤、男性不育、心血管疾病、兒童相關(guān)疾病等中發(fā)揮了重要作用[4,7-9,12,17]。尿液作為機(jī)體代謝物的集中池，因其無侵入性，收集方便，易被患者所接受，因此尿液中DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物8-oxodGuo在未來將很可能被廣泛用于疾病的監(jiān)測，本研究建立的UPLC-MS/MS檢測方法將有助于完善其對疾病的監(jiān)測。