潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜內(nèi)PKM2表達(dá)的變化及臨床意義*

步 楠，李?yuàn)檴櫍K 越，潘克明

(黑龍江省佳木斯市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科 154002)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一類(lèi)重要累及結(jié)直腸黏膜及黏膜下層的非特異性炎癥性腸病，以腸黏膜病變復(fù)發(fā)與緩解交替發(fā)生為特征[1-2]，發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，臨床上也缺乏靶向治療手段及特異性篩查指標(biāo)。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)家族包括PKL、PKR、PKM1、PKM2 4種亞型，其中PKM2被證實(shí)在UC發(fā)病中起保護(hù)作用，敲除PKM2使葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC小鼠病變加重、造成腸黏膜內(nèi)炎性反應(yīng)激活及腸黏膜屏障損傷[3]。但目前尚缺乏PKM2在UC發(fā)病中所起作用的臨床證據(jù)。因此，本研究將以UC患者為對(duì)象，首先分析UC腸黏膜內(nèi)PKM2表達(dá)的變化，而后從病情加重、炎性反應(yīng)激活、腸黏膜屏障損傷的角度分析PKM2表達(dá)變化的臨床意義，旨在為闡明PKM2在UC發(fā)病中的作用提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2020年6月在本院診斷為UC的患者，60例活動(dòng)期UC患者作為活動(dòng)期UC組、40例緩解期UC患者作為緩解期UC組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2018年·北京)》[4]中活動(dòng)期UC或緩解期UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料、腸黏膜標(biāo)本完整；(3)取得患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他自身免疫性疾病；(2)合并惡性腫瘤、急慢性感染、糖尿病；(3)伴有心、肝、腎、肺功能不全。另取同期在本院診斷為腸息肉的60例患者作為對(duì)照組。3組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組間一般資料的比較

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) PKM2的表達(dá)

取3組腸黏膜組織標(biāo)本適量，制作病理切片后采用SABC-AP免疫組織化學(xué)試劑盒(上海信帆生物科技公司)對(duì)切片PKM2進(jìn)行染色，按照說(shuō)明書(shū)完成操作。在顯微鏡下觀察染色強(qiáng)度及陽(yáng)性染色細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度計(jì)分如下：無(wú)染色0分、淺棕黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分；陽(yáng)性染色細(xì)胞比例計(jì)分如下：<5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。2項(xiàng)評(píng)分相乘，0～1分為陰性、≥2分為陽(yáng)性。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)PKM2 mRNA的表達(dá)

取3組腸黏膜組織標(biāo)本適量，采用TRIzol試劑盒(北京天根公司)提取組織中的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)cDNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，按照說(shuō)明書(shū)完成操作。PCR的20 μL反應(yīng)體系為cDNA 1 μL、反應(yīng)混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去離子水7.8 μL；PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s、特異性退火溫度(PKM2 58.0 ℃、β-actin 60.0 ℃)25 s、72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。完成PCR反應(yīng)后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin為內(nèi)參，按照公式2-ΔΔCt計(jì)算PKM2 mRNA表達(dá)水平。

1.4 Western blot檢測(cè)PKM2、閉鎖連接蛋白-1(ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)、密封蛋白-1(Claudin-1)的表達(dá)

取3組腸黏膜組織標(biāo)本適量，加入組織裂解液后勻漿，勻漿液于4 ℃、12 000×g離心20 min，分離上清液并采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將含有30 μg蛋白的上清液標(biāo)本用于Western blot實(shí)驗(yàn)。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜，5%脫脂牛奶封閉NC膜1～2 h，用HMGA2一抗(1∶1 000稀釋)、β-actin一抗(1∶5 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；次日，孵育過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)成像得到PKM2、ZO-1、Occludin、Claudin-1及β-actin的蛋白條帶，在ImageJ軟件中計(jì)算條帶灰度值，根據(jù)蛋白條帶灰度值計(jì)算PKM2、ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達(dá)水平。

1.5 活動(dòng)期UC病情的評(píng)估

參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2018年·北京)》[4]，采用Mayo臨床評(píng)分、Mayo內(nèi)鏡評(píng)分、Geboes指數(shù)評(píng)估活動(dòng)期UC患者的病情。

1.6 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測(cè)

由醫(yī)院檢驗(yàn)科完成以下實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的測(cè)定：中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(neutrophils-lymphocytes ratio，NLR)、單核細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(monocyte-lymphocytes ratio，MLR)、血小板/淋巴細(xì)胞比值(platelet-to-lymphocyte ratio，PLR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)。

1.7 ELISA檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子水平

取活動(dòng)期UC組患者適量的腸黏膜組織標(biāo)本，加入組織裂解液后勻漿，采用ELISA試劑盒(上海西唐公司)檢測(cè)勻漿液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組患者腸黏膜PKM2表達(dá)水平的比較

采用免疫組織化學(xué)法、熒光定量PCR法、Western blot法檢測(cè)PKM2的表達(dá)情況。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組比較，緩解期UC組腸黏膜PKM2的陽(yáng)性表達(dá)率、mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組、緩解期UC組比較，活動(dòng)期UC組腸黏膜PKM2的陽(yáng)性表達(dá)率、mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2，表2。

A:活動(dòng)期UC組；B:緩解期UC組；C:對(duì)照組。

圖2 Western blot法檢測(cè)腸黏膜PKM2的表達(dá)水平

表2 活動(dòng)期UC組、緩解期UC組與對(duì)照組腸黏膜PKM2表達(dá)的比較

2.2 活動(dòng)期UC組患者中PKM2陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者病情的比較

與活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)患者比較，PKM2陰性表達(dá)患者的Mayo臨床評(píng)分、Mayo內(nèi)鏡評(píng)分、Geboes指數(shù)均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者病情的比較

2.3 活動(dòng)期UC組患者中PKM2陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、黏膜屏障標(biāo)志物的比較

與活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)患者比較，PKM2陰性表達(dá)患者的ESR、CRP、NLR、MLR、PLR水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

2.4 活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者腸黏膜屏障標(biāo)志物的比較

與活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)患者比較，PKM2陰性表達(dá)患者腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表5。

圖3 Western blot檢測(cè)腸黏膜ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達(dá)

表5 活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者腸黏膜屏障標(biāo)志物表達(dá)的比較

2.5 活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者腸黏膜炎癥細(xì)胞因子的比較

與活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)患者比較，PKM2陰性表達(dá)患者腸黏膜內(nèi)TNF-α、IL-6水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 活動(dòng)期UC組中PKM2陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者腸黏膜內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的比較

3 討 論

PKM2是PK家族的成員之一，既能在糖酵解過(guò)程中起到催化作用，也能在基因表達(dá)調(diào)控中起到轉(zhuǎn)錄輔助因子作用。目前已知在宮頸癌[5]、食管癌[6]、前列腺癌[7]等惡性腫瘤的發(fā)病過(guò)程中PKM2參與多種癌基因表達(dá)的調(diào)控，惡性腫瘤病灶內(nèi)高表達(dá)的PKM2介導(dǎo)了促增殖、抗凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。近年關(guān)于UC發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，多項(xiàng)研究證實(shí)腸黏膜上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡與UC的發(fā)病密切相關(guān)[8-9]。1項(xiàng)PKM2與UC相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC小鼠中，敲除PKM2使腸黏膜病理改變加重[3]，提示PKM2表達(dá)降低或缺失可能參與UC的發(fā)病。

本研究以UC患者為對(duì)象，首先通過(guò)檢測(cè)PKM2表達(dá)的方式探究PKM2在UC發(fā)病中的作用。經(jīng)免疫組織化學(xué)、熒光定量PCR及Western blot 3種方法檢測(cè)PKM2的表達(dá)，3種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，即與緩解期UC及結(jié)腸息肉患者比較，活動(dòng)期UC患者腸黏膜PKM2的表達(dá)水平明顯降低。SUN等[3]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)PKM2在UC發(fā)病過(guò)程中起保護(hù)作用、能夠減輕UC病變。Mayo臨床評(píng)分、Mayo內(nèi)鏡評(píng)分、Geboes指數(shù)是目前臨床上評(píng)估活動(dòng)期UC病情的常用手段[10-11]，本研究分析了PKM2表達(dá)與UC病情的關(guān)系，結(jié)果顯示：PKM2陰性表達(dá)患者的Mayo臨床評(píng)分、Mayo內(nèi)鏡評(píng)分、Geboes指數(shù)更高，表明PKM2表達(dá)缺失與活動(dòng)期UC病情加重有關(guān)，與PKM2在UC小鼠中介導(dǎo)的腸黏膜保護(hù)作用結(jié)論一致。

UC是一類(lèi)非特異性炎癥介導(dǎo)的炎癥性腸病，臨床上多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)能夠評(píng)估炎性反應(yīng)程度，與UC病情發(fā)展變化相關(guān)。CRP和ESR是評(píng)價(jià)多種自身免疫性疾病活動(dòng)的指標(biāo)，NLR、MLR、PLR是新近發(fā)展起來(lái)的炎癥指標(biāo)。中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在炎性反應(yīng)激活過(guò)程中能夠釋放多種炎癥介質(zhì)，UC腸黏膜內(nèi)2種細(xì)胞的浸潤(rùn)均明顯增多[12-13]，淋巴細(xì)胞在炎性反應(yīng)中的作用較為復(fù)雜，多數(shù)研究認(rèn)為在炎癥激活過(guò)程中淋巴細(xì)胞的成熟受阻[14]，因此NLR和MLR的升高反映了UC發(fā)病過(guò)程中炎性反應(yīng)的過(guò)度激活[15-16]。本研究通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的分析進(jìn)一步驗(yàn)證PKM2在活動(dòng)期UC病情發(fā)展變化中的作用，PKM2陰性表達(dá)患者的ESR、CRP、NLR、MLR、PLR水平較高，表明活動(dòng)期UC發(fā)病過(guò)程中PKM2表達(dá)缺失與炎性反應(yīng)的過(guò)度激活有關(guān)，這與PKM2表達(dá)缺失與活動(dòng)期UC病情加重有關(guān)的結(jié)果一致，進(jìn)一步提示腸黏膜內(nèi)PKM2表達(dá)缺失與活動(dòng)期UC病情加重有關(guān)。

SUN等[3]和步楠等[17]在UC小鼠中通過(guò)基因敲除的方法證實(shí)了PKM2參與腸黏膜內(nèi)炎性反應(yīng)的調(diào)控。在敲除PKM2后，UC小鼠腸黏膜內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平增加，同時(shí)細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達(dá)水平降低。TNF-α、IL-6具有促炎活性，在UC發(fā)病過(guò)程中其生成增多介導(dǎo)了腸黏膜炎性反應(yīng)的激活[18]；ZO-1、Occludin、Claudin-1能夠維持腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接，在UC發(fā)病過(guò)程中其表達(dá)降低造成了黏膜屏障損傷[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期UC發(fā)病過(guò)程中PKM2陰性表達(dá)患者腸黏膜內(nèi)TNF-α、IL-6的表達(dá)水平增加，ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達(dá)水平降低，與PKM2在UC小鼠中調(diào)控炎性反應(yīng)及腸黏膜屏障的作用吻合，提示PKM2表達(dá)缺失可能通過(guò)激活炎性反應(yīng)，加重腸黏膜屏障損傷的方式參與活動(dòng)期UC的發(fā)病。

綜上所述，本研究認(rèn)為腸黏膜內(nèi)PKM2表達(dá)降低與活動(dòng)期UC的發(fā)病有關(guān)，并且腸黏膜內(nèi)PKM2表達(dá)缺失與活動(dòng)期UC病情加重、炎性反應(yīng)激活、腸黏膜屏障損傷有關(guān)。本研究的上述臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)為今后探究UC發(fā)病機(jī)制及防治靶點(diǎn)提供了新思路。