miR-135a-5p通過調(diào)控Bcl-2/Bax通路對青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的作用機制*

謝九冰，楊杉杉，陳喜月，岳向東

(河北省唐山市眼科醫(yī)院青光眼科 063000)

青光眼是當(dāng)今世界范圍內(nèi)的主要致盲性眼病之一，主要表現(xiàn)為視神經(jīng)生理凹陷擴大、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells,RGCs)進行性缺損，其中RGCs凋亡和視神經(jīng)纖維丟失是青光眼致盲的病理基礎(chǔ)[1-2]。研究認為，眼壓升高是青光眼的主要致病因素，臨床治療以降眼壓為主，青光眼致病原因復(fù)雜，除與高眼壓有關(guān)外，單純降眼壓不能完全阻止青光眼病情發(fā)展。有研究認為RGCs凋亡與青光眼的發(fā)病有密切關(guān)系，研究影響青光眼發(fā)病過程中的RGCs凋亡特點成為新的方向[3]。RGCs凋亡受多種因素影響，已經(jīng)證實與營養(yǎng)因子中斷、血液供應(yīng)異常、谷氨酸及一氧化氮增多、基因突變等因素有關(guān)[4]。研究表明微RNA(microRNA,miRNAs)對軸突生長具有較強的影響，miRNAs的表達在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后發(fā)生變化[5]。miR-135家族成員如miR-135a、miR-135b、miR-135s的表達在特定類型的細胞中通過不同方式影響細胞增殖、分化和形成。研究證實miR-135a和miR-135b在體內(nèi)和體外均能刺激雄性和雌性小鼠軸突生長和皮質(zhì)神經(jīng)元遷移,而miR-135s對損傷后軸突再生具有一定影響[6]。玻璃體內(nèi)應(yīng)用miR-135s可通過抑制Krüppel樣因子4(KLF4)促進成年小鼠視神經(jīng)損傷后RGCs軸突再生，相反，miR-135s的缺失降低了RGCs軸突的再生[7-8]。miR-135a-5p被證明是轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅰ(transforming growth factor-β Ⅰ,TGFBR1)/轉(zhuǎn)化生長因子-β激活激酶1(TGF-β activated kinase-1,TAK1)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，乙醇誘導(dǎo)的miR-135a下調(diào)可能通過上調(diào)Siah1和激活p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p53通路而致使神經(jīng)嵴細胞(NCCs)凋亡[9]。但miR-135a-5p對青光眼RGCs是否也有影響還尚不清楚。本研究將重點探究miR-135a-5p對青光眼RGCs凋亡的影響機制，希望為治療青光眼提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

BALB/C雄性小鼠購自北京永欣康泰科技發(fā)展有限公司，實驗用RGCs購自上海斯信生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自北京天恩澤生物技術(shù)有限公司；重組腺病毒miR-135a-5p模擬物、重組腺病毒 miR-135a-5p抑制物、重組腺病毒空白載體購自上海博邦醫(yī)藥科技有限公司；LipofectamineTM2000、miRNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測試劑盒及兔抗鼠Bcl-2、Bax蛋白多克隆抗體、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自北京百奧萊博科技有限公司，CCK-8細胞計數(shù)及細胞凋亡相關(guān)試劑盒購自上海碧云天生物公司，流式細胞儀和基因擴增儀購自美國Beckman公司。

1.2 青光眼RGCs模型建立

選取60只小鼠，將小鼠隨機分為對照組20只、模型1組20只、模型2組20只。對照組小鼠不做任何處理，模型1、2組小鼠采用532 nm氬激光光凝小鼠小梁網(wǎng)組織建立小鼠青光眼模型[7]：采用5 mg/kg甲苯噻嗪混合液和80 mg/kg鹽酸氯胺酮行腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠，用質(zhì)量分數(shù)0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液點眼進行局部麻醉，532 nm氬激光擊射小鼠角膜緣周圍的小梁網(wǎng)組織，光斑為60～100個，直徑50 mm，激光能量為300 mW，發(fā)射時間0.5 s,分別于術(shù)前，術(shù)后7、14 d使用TonoLab回彈式眼壓計測量眼壓，分別于造模第7天處死模型1組，造模第14天時處死模型2組及對照組小鼠獲取視網(wǎng)膜標(biāo)本用于檢測RGCs凋亡率和miR-135a-5p表達水平。模型1、2組共成功建立青光眼RGCs模型小鼠36只，每組18只。

1.3 熒光金逆行標(biāo)記檢測模型鼠視網(wǎng)膜中RGCs數(shù)量

造模前4 d行 RGCs熒光金逆行標(biāo)記，小鼠麻醉后固定于立體定位儀，沿顱頂正中線切開皮膚，以后囟中心為原點前移2 mm并旁開1.2 mm，用電鉆鑿直徑約1 mm的骨孔，孔內(nèi)緩慢注入2% 熒光金，止血，縫合皮膚。取于造模第14天處死的對照組和模型2組小鼠，取出眼球并置于質(zhì)量分數(shù)4×多聚甲醛中固定1.5 h，于生理鹽水中剝離視網(wǎng)膜，以視盤為中心行十字狀剪開，將內(nèi)層朝向蓋玻片平鋪視網(wǎng)膜，抗淬滅劑封片。用激光掃描共聚焦顯微鏡采集全視網(wǎng)膜圖像，采用Image J軟件分別計數(shù)距視盤1～2、>2～3和>3～4 mm處熒光金標(biāo)記的RGCs。計算每平方毫米面積內(nèi)RGCs數(shù)量。

1.4 RT-qPCR檢測小鼠視網(wǎng)膜miR-135a-5p表達水平

提取建模小鼠視網(wǎng)膜細胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。所有樣品均重復(fù)測定3 次。引物序列miR-135a-5p正向5′-GGC AGC AAA GTT CTG AGA CAC-3′，反向5′-GTG CAG GGT CCG AGG TAT TC-3′；U6正向5′-CTC GCG CAG CCT TGA CA-3′;反向5′-AAC TTC GGA ATT GCA CTC GT-3′。取模板cDNA 2 μL進行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-135a-5p表達水平。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染及分組

復(fù)蘇RGCs，于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基[培養(yǎng)基添加青、鏈霉素和非必需氨基酸(1∶1 000)混合液]進行培養(yǎng)。將細胞分為3組，miR-135a-5p組轉(zhuǎn)染miR-135a-5p mimic(序列為5′-UAU GGC UUU UUA UUC CUA UGU GA-3′)，空白組轉(zhuǎn)染無意義序列miRNA-NC(序列為5-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′)，miR-135a-5p抑制組轉(zhuǎn)染si-miR-135a-5p(序列為5′-GGU UGG UAG ACA UGU UAA AdTdT-3′)，按照Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡

取各組細胞，胰蛋白酶消化收集細胞，離心，棄上清液，重懸細胞，加入2～3 mL預(yù)冷的70%冰乙醇，吹打均勻，置4 ℃冰箱中固定48 h，經(jīng)1 000 r/min離心5 min棄乙醇，重懸后加入碘化丙啶(PI，100 mg/L)染液，在室溫條件下避光混合30 min，采用流式細胞儀(美國Beckman公司)，激發(fā)光源為15 mW氬離子激發(fā)器，激發(fā)波長488 nm，應(yīng)用Expo3.2 ADC分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用Muticycle AV軟件對細胞周期及凋亡進行分析。

1.7 CCK-8檢測RGCs活性

取各組細胞，并增設(shè)1個不含細胞的空白組和有細胞但不轉(zhuǎn)染對照組，每組設(shè)3個平行組，以1.5×103/孔細胞濃度接種細胞至96孔板，進行細胞轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h，加入10 μL CCK-8培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀測定各孔波長450 nm處的吸光(A)值，計算細胞活性， 各轉(zhuǎn)染組細胞活性=[轉(zhuǎn)染組A值-空白組A值]/[對照組A值-空白組A值]×100%。

1.8 Western blot 測定RGCs中Bcl-2、Bax蛋白表達水平

冰上加RPMI裂解液裂解各組細胞，取上清液，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入兔抗鼠Bcl-2、Bax、GAPDH蛋白一抗(1∶2 000)，GAPDH為參照，4 ℃孵育過夜。加入羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，Image J軟件分析蛋白條帶灰度。

1.9 EdU檢測miR-135a-5p對RGCs增殖的影響

取各組細胞接種至12孔板，5×104/孔，48 h后更換10 μmol/L Edu培養(yǎng)基(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，孵育2 h，4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染，去除培養(yǎng)基，PBS清洗。嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進行實驗步驟操作后，熒光顯微鏡拍照，Edu陽性細胞為紅色代表增殖細胞數(shù)， DAPI陽性細胞為藍色代表細胞總數(shù)，細胞增值率=Edu陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%。

1.10 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-135a-5p與Bcl-2、Bax的相互作用關(guān)系

在http://www.targetscan.org/vert_72/網(wǎng)站對miR-135a-5p的靶基因進行預(yù)測，篩選出Bcl-2的3′ 非編碼區(qū)(3′ UTR)與miR-135a-5p存在連續(xù)互補核苷酸序列。構(gòu)建Bcl-2-3′ UTR野生型(WT)質(zhì)粒、Bcl-2-3′ UTR突變型(MUT)質(zhì)粒。將Bcl-2-3′ UTR的WT、MUT質(zhì)粒與miR-NC、miR-135a-5p mimics共轉(zhuǎn)染入RGCs，分為WT+miR-NC組、WT+miR-135a-5p mimics組、MUT+miR-NC組、MUT+miR-135a-5p mimics組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細胞。按雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書步驟檢測熒光素酶活性。相同方法檢測Bax。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-135a-5p在青光眼小鼠模型RGCs中的表達變化

采用氬激光光凝小梁網(wǎng)建立青光眼小鼠模型，隨著模型處理時間增加，miR-135a-5p表達逐漸降低，RGCs活細胞數(shù)量減少。對照組、模型1組、模型2組間miR-135a-5p、RGCs活細胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 miR-135a-5p在小鼠青光眼視網(wǎng)膜RGCs中的表達

2.2 各組RGCs miR-135a-5p的表達水平變化及其對RGCs活性的影響

PCR結(jié)果表明，miR-135a-5p組中miR-135a-5p高于空白組，而空白組高于miR-135a-5p抑制劑組(P<0.05)。CCK-8實驗結(jié)果表明miR-135a-5p組RGCs活性高于空白組，空白組高于miR-135a-5p抑制劑組(P<0.05)。見表2。

表2 miR-135a-5p對RGCs活性的影響

2.3 miR-135a-5p對RGCs凋亡率的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果表明，與空白組[(24.647±5.924)%]比較，miR-135a-5p組[(11.244±3.537)%]細胞凋亡率降低(F=67.251，P<0.05)，miR-135a-5p抑制劑組[(31.752±8.068)%]細胞凋亡率增加(F=60.460，P<0.05)，見圖1。

2.4 miR-135a-5p對RGCs增殖的影響

EdU實驗結(jié)果表明，與空白組比較，miR-135a-5p組細胞增殖顯著增加，miR-135a-5p抑制劑組顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組RGCs凋亡分析

A：EdU顯微熒光圖(100×)；B：EdU實驗統(tǒng)計分析圖；a:P<0.05,與空白組比較。

2.5 miR-135a-5p對RGCs 中Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，miR-135a-5p組RGCs中Bcl-2蛋白表達水平高于空白組，空白組高于miR-135a-5p抑制劑組(P<0.05)；miR-135a-5p組Bax蛋白表達水平低于空白組，空白組低于miR-135a-5p抑制劑組(P<0.05)；miR-135a-5p組Bcl-2/Bax值高于空白組，空白組高于miR-135a-5p抑制劑組(P<0.05)。見圖3、表3。Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-135a-5p表達水平與Bcl-2呈正相關(guān)(r=0.523，P=0.000)，與Bax呈負相關(guān)(r=-0.632，P<0.001)。

表3 各組RGCs 中Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

圖3 RGCs 中Bcl-2、Bax蛋白表達

2.6 miR-135a-5p靶向調(diào)控Bcl-2/Bax表達

Targetscan預(yù)測顯示，Bcl-2、Bax的3′ UTR部分堿基與miR-135a-5p存在連續(xù)互補配對序列。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示， Bcl-2、Bax對應(yīng)的MUT+miR-135a-5p mimics組與MUT+miR-NC組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義， WT+miR-135a-5p mimics組較WT+miR-NC組熒光素酶活性顯著降低，見圖4。

A：Bcl-2堿基互補配對序列和雙熒光素酶檢測報告；B：堿基互補配對序列和雙熒光素酶檢測分析報告；a:P<0.05,與miR-NC組比較。

3 討 論

青光眼的共同特征是視神經(jīng)的進行性退化，形態(tài)學(xué)特征可檢測到RGCs喪失，小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)損傷，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄等[10]。青光眼致病可能與免疫反應(yīng)相關(guān)的多個基因或途徑的變化相關(guān)，以及視神經(jīng)乳頭(ONH)的結(jié)構(gòu)和炎癥變化有關(guān)。而大量證據(jù)表明，在人類和實驗性青光眼模型中，RGCs凋亡是最終的共同途徑[11]，當(dāng)前對于視網(wǎng)膜神經(jīng)保護的研究集中在阻止RGCs凋亡的思路上，如以神經(jīng)保護治療為目的的基因治療，即通過轉(zhuǎn)染腺病毒載體引入DNA分子轉(zhuǎn)移至視網(wǎng)膜RGCs內(nèi)，抑制其凋亡[12]。因此尋找可以影響RGCs凋亡的靶基因是探索治療青光眼方法的重要研究方向。

miRNA涉及所有的生物進程，可以通過其表達變化，參與調(diào)控個體發(fā)育和細胞凋亡、增殖等活動[13]。研究顯示，人眼中miRNA在神經(jīng)視網(wǎng)膜、神經(jīng)膜色素上皮和脈絡(luò)膜中表現(xiàn)出高度選擇性，發(fā)揮獨特功能。在常見眼部疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜色素變性、青光眼中均有相關(guān)報道表明miRNA參與其中[14]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在眼壓波動、小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)重塑、促進神經(jīng)再生等青光眼發(fā)病和治療過程中有重要的調(diào)控作用，如miR-29b可負向調(diào)節(jié)小梁網(wǎng)細胞的外基質(zhì)合成，miRNA-200c在青光眼眼壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，可降低眼壓[15]。視網(wǎng)膜中miR-135水平的降低進一步降低了RGCs軸突的再生。在神經(jīng)元細胞中miR-135b和miR-135a可發(fā)揮軸突生長和神經(jīng)元遷移促進因子的作用[16]。此外，玻璃體內(nèi)應(yīng)用miR-135s有助于成年小鼠視神經(jīng)損傷后RGCs軸突的再生[17]。本研究中采用氬激光光凝小梁網(wǎng)建立小鼠青光眼模型，隨著處理作用時間增加，miR-135a-5p表達水平逐漸降低，14 d時miR-135a-5p表達水平最低，提示miR-135a-5p在青光眼RGCs中呈低表達，動物模型結(jié)果顯示在處理后的RGCs中miR-135a-5p表達水平及RGCs凋亡率均隨著模型建立時間的延長而降低，說明青光眼可造成miR-135a-5p表達降低，RGCs凋亡增加，而已有研究表明RGCs凋亡是青光眼的病理特征之一，并證實青光眼患者RGCs凋亡是增加的[18]，這與以往研究結(jié)果一致。

RGCs凋亡是引起大部分視覺神經(jīng)損傷的主要原因，因此研究青光眼環(huán)境對RGCs凋亡的影響很有意義[19]。 miRNAs可參與青光眼的發(fā)病過程，多種miRNA如miR-29b、miRNA-200c已經(jīng)被證實參與調(diào)控青光眼的發(fā)生發(fā)展[20]。miR-135b和miR-135a可通過抑制鋅指樣核轉(zhuǎn)錄因子4(KLF4)促進軸突生長，來刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突的再生，KLF4是miR-135a和miR-135b在神經(jīng)元中的靶點[21]。另外KLF4還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元的固有軸突生長能力，視神經(jīng)擠壓實驗表明，KLF4的下調(diào)和JAK-STAT3信號的激活可顯著誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)境中再生軸突的生長[22]。本研究體外細胞實驗顯示RGCs內(nèi)miR-135a-5p表達水平明顯降低，同時RGCs凋亡率增加，可以推測miR-135a-5p可能參與了RGCs凋亡的調(diào)節(jié)。當(dāng)miR-135a-5p表達水平被抑制后，RGCs的細胞活性明顯降低，增加miR-135a-5p表達水平后RGCs的細胞活性增加，提示miR-135a-5p可能在RGCs的生長過程中發(fā)揮了重要作用，通過對RGCs凋亡率和增殖的進一步研究顯示，miR-135a-5p抑制劑組在抑制miR-135a-5p后RGCs凋亡率較空白組增加，而在增加miR-135a-5p表達水平后RGCs凋亡率較空白組減少，同時通過EdU實驗檢測發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p表達水平上調(diào)后， RGCs增殖顯著增加，miR-135a-5p表達水平下調(diào)后，RGCs增殖顯著降低，說明miR-135a-5p在RGCs的凋亡中發(fā)揮抑制作用，并能促進細胞增殖。

青光眼中RGCs死亡機制尚不明確，但已經(jīng)有較多研究證實是通過細胞凋亡途徑實現(xiàn)的[23]。大量研究證實凋亡相關(guān)基因Bcl-2可抑制細胞凋亡。線粒體Bax是促凋亡基因，是細胞凋亡過程的關(guān)鍵節(jié)點處的單通道，是不同凋亡過程不可繞過的共有環(huán)節(jié)[24-25]。也有研究發(fā)現(xiàn)正常情況下，Bcl-2與Bax比值處于動態(tài)平衡，當(dāng)Bcl-2表達高于Bax表達時，細胞趨向存活，反之則趨向凋亡[26]。本研究中雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示miR-135a-5p可靶向調(diào)控Bcl-2、Bax表達，抑制miR-135a-5p后RGCs中Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平增加，而Bcl-2/Bax降低，但上調(diào)miR-135a-5p表達后，Bcl-2、Bax蛋白具有相反的表達情況，說明miR-135a-5p可影響RGCs內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白的表達水平，進而對RGCs凋亡產(chǎn)生影響。提示miR-135a-5p可能通過調(diào)控Bcl-2/Bax影響RGCs的凋亡。

綜上，miR-135a-5p在RGCs中表達降低，miR-135a-5p高表達能降低RGCs的凋亡，其機制可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax來實現(xiàn)的。因此，可通過調(diào)控miR-135a-5p表達實現(xiàn)調(diào)控青光眼RGCs的凋亡。這為青光眼的預(yù)防、治療及預(yù)后分析提供理論基礎(chǔ)。但本研究也有一定不足，本研究并未針對其機制和調(diào)控通路做深入研究，本課題組將在后續(xù)工作中繼續(xù)探究。