核心蛋白聚糖在胰腺癌beta細胞功能中的作用及對線粒體分離融合的影響*

張 榮，呂海龍，楊一邨，王浩斌，黃江濤，張 抒

(四川省成都市第三人民醫院普外科 610031)

胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤之一。其預后差，生存率低[1]。隨著我國人口老齡化和糖尿病發病率的升高，胰腺癌將成為危害我國國民健康的重大疾病之一[2]。然而，目前關于胰腺癌依舊缺乏行之有效的診斷和治療手段[1-2]。胰腺癌常分為胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)和胰腺神經內分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine tumors，PNET)。最新證據顯示，占據胰腺癌95%的PDAC與代謝紊亂導致的骨骼肌、脂肪和腫瘤細胞消耗增加密切相關[3-4]。但目前對胰腺癌的代謝和分子機制尚未闡明。

核心蛋白聚糖(decorin，DCN)是富含亮氨酸的小蛋白聚糖家族的重要成員[5]。研究報道，DCN具有調控癌細胞和內皮細胞增殖、凋亡，巨噬細胞極化和小鼠糖耐受等作用[6-7]。DCN通過過氧化物酶體增殖物激活的受體γ共激活分子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α，PGC1-α)調控米托他汀誘導乳腺癌細胞的線粒體自穩[8]。DCN可誘導血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)依賴性的線粒體片段化和線粒體膜電位的喪失[5]。DCN介導的抑癌作用作為上皮癌潛在的未來輔助療法具有重要價值[9]。線粒體的分離融合是細胞生長及其功能的代謝基礎。然而，DCN與線粒體的分離融合在胰腺癌發生發展中的作用尚未見報道。本研究通過研究胰腺癌組織中DCN的表達和其對胰島β細胞線粒體的分離融合的影響與分子機制，以揭示DCN和胰腺癌胰β細胞島線粒體的分離融合失衡間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

征集2018年6月至 2021 年2月本院診斷為PDAC患者21例(PDAC組)，PNET患者25例(PNET組)及健康志愿者4例(健康組)。收集患者腫瘤組織及健康志愿者胰腺組織。(1)PCAC及PENET患者診斷和納入標準：手術前未經放化療等任何形式的治療；經影像學診斷且腫瘤標志物CA19-9陽性。(2)排除標準：合并其他惡性腫瘤及存在嚴重器質性疾病者；伴精神疾病者或認知障礙者。PDAC組患者年齡(49.65±5.85)歲；PNET組患者年齡(52.96±8.85)歲。健康組人群的年齡(40.21±4.33)歲。本文研究經本院倫理委員會審核批準，所有患者、志愿者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學檢測

組織置于4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水、包埋并切片、脫蠟和水化。采用檸檬酸緩沖液高溫修復30 min。加入兔抗人DCN多克隆抗體(1∶200，武漢三鷹生物技術有限公司)，4 ℃過夜，PBS漂洗3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶500，武漢Abclonal公司)，室溫孵育 1 h，PBS漂洗3次，每次5 min。DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司)顯色1 min，自來水沖洗5 min。ddH2O漂洗5 min。常規復染，脫水，透明和封片。采用Image-Pro Plus 6.0分析其染色情況。

1.3 免疫熒光檢測

組織置于4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水、包埋并切片、脫蠟和水化。采用檸檬酸緩沖液高溫修復30 min。加入兔抗人MFN2多克隆抗體和小鼠抗人DRP1多克隆抗體(1∶200，武漢三鷹生物技術有限公司)，4 ℃過夜，PBS漂洗3次，每次5 min。加入FITC和CoraLite594標記的二抗(1∶500，武漢三鷹生物技術有限公司)，室溫孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min。DAPI染色30 s，PBS漂洗3次，每次5 min。抗熒光淬滅劑(武漢塞維爾生物科技有限公司)封片，熒光顯微鏡拍照，采用Image-Pro Plus 6.0分析其染色面積。

1.4 小鼠胰島β細胞培養及分組

小鼠胰島β細胞NIT-1在含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養。胰酶消化重懸，懸液500×g 4 ℃離心10 min后計數并接種至細胞培養板中，置于37 ℃ 5% CO2孵箱培養24 h后，更換2% 胎牛血清培養基培養6 h同步化，更換完全培養基，依次加入0、1、10、100和200 nmol/L DCN處理0、12、24和48 h。或更換為含0 nmol/L或100 nmol/L的DCN(D8428，美國Sigma-Aldrich)的正常葡萄糖培養基或高糖(HG)培養基(武漢塞維爾生物科技有限公司)培養24 h,分為正常糖條件下的0 nmol/L DCN組、10 nmol/L DCN組和高糖條件下的0 nmol/L DCN組、10 nmol/L DCN組。

1.5 CCK-8實驗

細胞增殖實驗采用CCK-8比色法檢測，參照CCK-8試劑盒說明書，細胞經消化計數后，以2×103/孔的細胞數接種細胞至96孔培養板中，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，混勻后培養2 h后于450 nmol/L處檢測各孔光密度(OD)值，繪制細胞增殖曲線圖。

1.6 流式細胞實驗

對數生長期的細胞經消化計數后，以5×104/孔的數接種細胞至12孔培養板中，37 ℃ 5% CO2培養24 h后，更換為HG培養基(武漢塞維爾生物科技有限公司)和(或)100 nmol/L的PCN培養24 h。每孔細胞以乙二胺四乙酸(EDTA)消化液消化收集細胞，冷PBS洗滌3次，細胞沉淀加入1% BSA 400 μL重懸后，加入2.5 μL Annexin V-FITC抗體(上海碧云天生物科技有限公司),室溫孵育30 min,PBS洗滌1次，400 μL PBS重懸后加入2.5 μL 碘化丙啶(PI)染料(武漢塞維爾生物科技有限公司)，并使用LSR-Ⅱ流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)進行檢測。使用FlowJo軟件對結果進行分析。

1.7 胰島素檢測實驗

取細胞培養上清液100 μL，按胰島素ELISA檢測試劑盒(上海碧云天生物)使用說明書操作，使用BioTek 5.0酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.8 Western blot檢測

取組織加入1 mL含蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液(武漢塞維爾生物科技有限公司)，組織置于玻璃組織勻漿器中，于冰上充分碾碎組織，冰上孵育10 min。收集至1.5 mL Ep管中，超聲10 s，2個循環。14 000×g 4 ℃離心 20 min后收集上清。細胞加入0.5 mL含蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上孵育10 min，收集至1.5 mL Ep管中，超聲 10 s，2個循環。14 000×g 4 ℃離心 20 min后收集上清液。上清液采用BCA法檢測蛋白濃度并95 ℃干熱變性10 min。組織以60 μg總蛋白，細胞以30 μg總蛋白上樣量行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，200 mA恒流濕轉2 h至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，5% BSA的TBST溶液室溫封閉1 h，加入一抗DCN、線粒體分裂因子(MFF)、線粒體融合蛋白1(MFN1)、MFN-2、視神經萎縮癥蛋白1(OPA1)、動力相關蛋白1(DRP1)、線粒體分裂蛋白1(FIS1)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(P22phox)、絲裂原活化蛋白激酶p38亞基(p38)、胰島素樣生長因子Ⅰ受體蛋白(IGFIR)、蛋白激酶B(AKT)和β-actin(1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000，武漢三鷹生物技術有限公司)及磷酸化AKT(p-AKT)和p-p38(1∶500，1∶500，武漢Abclonal公司)于4 ℃搖床孵育12 h，第2天TBST室溫漂洗3次，每次5 min。室溫孵育二抗(1∶5 000，武漢三鷹生物技術有限公司)2 h，TBST室溫漂洗3次，每次5 min。ECL(武漢塞維爾生物科技有限公司)發光顯影。蛋白表達ImageJ軟件分析灰度值，以β-actin為內參。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 胰腺癌患者組織中DCN的表達比較

免疫組織化學染色結果顯示，與健康組[(47.34±8.21)%]比較，PDAC組 [(36.81±11.15)%] 和PNET組 [(8.02±1.19 )%] 患者癌組織中DCN表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P=0.008，P=0.003)，見圖1A、B。Western blot結果顯示，PDAC組(3.23±0.75)和PNET組(1.20±0.37)患者癌組織中DCN表達水平和明顯低于與健康組(5.22±1.21)，差異有統計學意義(P=0.009，P=0.002)，見圖1C、D。

2.2 胰腺癌患者組織中線粒體功能比較

免疫熒光結果顯示PDAC組和PNET組患者胰腺癌組織胰島中MFN2表達水平分別為(22.64±8.34)%和(75.89±9.37)%，明顯高于健康組胰腺組織(9.73±0.51)%(P=0.042，P=0.010)；DRP1表達水平分別為(38.31±5.97)%和(19.93±7.21)%，明顯低于健康組(50.23±11.90)%(P=0.039，P=0.022)，見圖2A、B。Western blot結果顯示，線粒體融合相關蛋白MFN1、MFN2和OPA在PNET組胰腺癌組織(1.15±0.5,1.68±0.2和1.01±0.10)和PDAC組胰腺癌組織(1.19±0.40,0.79±0.30、0.65±0.20)中的表達水平明顯高于健康組胰腺組織(0.56±0.20，0.58±0.10、0.25±0.05)，其中PNET組vs.健康組P=0.045、0.047、0.041；PDAC組vs.健康組P=0.042、0.049、0.024；線粒體分裂相關蛋白DRP1、FIS1和MFF在PNET組胰腺癌組織(0.82±0.12，0.68±0.15、0.95±0.13)和PDAC組胰腺癌組織(0.79±0.34，0.67±0.22、1.85±0.49)中的表達水平明顯低于健康組胰腺組織(1.52±0.18、1.98±0.20和2.64±0.40)，其中PNET組vs.健康組P=0.035、0.021、0.044；PDAC組vs. 健康組P=0.039、0.025、0.047。見圖2C、D。

2.3 DCN對胰島β細胞增殖的影響

在正常糖條件下，相較于24和48 h的0 nmol/L DCN組(增殖倍數均為1)，100 nmol/L DCN組(3.75±0.18，3.96±0.16)和200 nmol/L DCN組(2.21±0.18，2.36±0.16)的細胞增殖倍數明顯增加(24 h：P=0.035、0.016；48 h：P=0.045、0.033)，見圖3A。在正常糖條件下，100 nmol/L DCN組的(5.22±0.42)細胞增殖倍數明顯高于0 nmol/L DCN組(3.96±0.42),P=0.012。在HG條件下，100 nmol/L DCN組的(2.16±0.16)細胞增殖倍數明顯高于0 nmol/L DCN組(1.36±0.16)，P=0.009，見圖3B。

A：DCN表達免疫組織化學代表圖(200×)；B：免疫組織化學統計分析圖；C：DCN Western blot圖；D：Western blot統計分析圖；a：P<0.01。

2.4 DCN對胰島β細胞凋亡的影響

在正常糖條件下，100 nmol/L DCN組[(1.54±0.16)%]的AnnexinV+PI-細胞比例與0 nmol/L DCN組[(1.25±0.15)%]比較無明顯變化(P=0.165)。在HG條件下，100 nmol/L DCN組(1.65±0.16)%的AnnexinV+PI-細胞比例與0 nmol/L DCN組[(2.68±0.56)%]比較，差異無統計學意義(P=0.472)，見圖4A、B。

A：MFN2和DRP1免疫熒光染色圖(100×)；B：免疫熒光分析統計圖；C：Western blot代表圖；D：Western blot統計分析圖；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.5 DCN對胰島β細胞胰島素分泌和線粒體分裂、融合的影響

在正常糖和HG條件下，100 nmol/L DCN組細胞培養上清液中的胰島素分泌量分別為(4.65±0.25)μg/mL和(1.75±0.18) μg/mL，分別高于正常糖條件下[(3.75±0.25) μg/mL]和HG條件下[(1.21±0.18) μg/mL]0 nmol/L DCN組，差異有統計學意義(P=0.042，P=0.049)，見圖5A。在正常糖條件下，相較于0 nmol/L DCN組(0.85±0.15、0.68±0.15、1.32±0.12)，100 nmol/L DCN組(2.58±0.16、1.71±0.16、2.50±0.25)的線粒體分裂相關蛋白DRP1、FIS1和MFF表達水平明顯增加(P=0.012、0.034、0.013)。在正常糖條件下，相較于0 nmol/L DCN組(1.15±0.15、1.68±0.14、1.16±0.12)，100 nmol/L DCN組(0.56±0.20、0.58±0.10、0.25±0.05)的線粒體融合相關蛋白MFN1、MFN2和OPA表達水平明顯減少(P=0.042、P=0.015、P=0.024)。在HG條件下，相較于0 nmol/L DCN組(1.45±0.43)，100 nmol/L DCN組(1.12±0.18)的線粒體分裂相關蛋白DRP1表達水平明顯減少(P=0.048)；在HG條件下，相較于0 nmol/L DCN組(2.45±0.20、1.19±0.10)，100 nmol/L DCN組(0.62±0.26、0.82±0.16)的線粒體融合相關蛋白MFN2和OPA表達明顯減少，差異有統計學意義(P=0.014和P=0.041)，見圖5B、C。

A:細胞增殖倍數統計圖；B：正常糖和HG條件下細胞增殖倍數統計圖；a：P<0.05；b：P<0.01。

A：流式細胞圖； B：流式細胞統計圖；a：P<0.05。

A、C：Western blot圖；B、D：Western blot統計分析圖；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.6 DCN對P22phox/MAPK通路和IGFIR/AKT通路的影響

在正常糖和HG條件下，相較于0 nmol/L DCN組，100 nmol/L DCN 組的P22phox[正常糖條件：1.52±0.18vs.2.58±0.16,P=0.031；HG條件：0.22±0.12vs.0.55±0.05,P=0.024)和p-p38(正常糖條件：1.08±0.20vs.1.91±0.16,P=0.024；HG條件：0.48±0.15vs. 0.98±0.15,P=0.025)表達水平明顯增加，差異有統計學意義，見圖6A、B。在正常糖和HG條件下，0 nmol/L DCN組和100 nmol/L DCN 組的IGFIR蛋白表達水平無明顯變化(正常糖條件：P=0.961；HG條件：P=0.879)，見圖6C、D；在正常糖下，100 nmol/L DCN組p-AKT蛋白(1.56±0.15)表達水平明顯高于0 nmol/L DCN組(0.56±0.20)，差異有統計學意義(P=0.019)，見圖6C、D。

A、C：Western blot圖；B、D：Western blot統計分析圖；a：P<0.05。

3 討 論

近年來，越來越多的證據表明，重新編程的代謝可能在胰腺癌的發生發展、治療和預后中起關鍵作用[10]。研究報道，線粒體融合過程可以使胰腺癌破碎的線粒體正常化，并降低氧化磷酸化，從而抑制腫瘤生長和改善患者的存活率[11]。在哺乳動物中，線粒體是眾所周知的重要細胞器，線粒體的分裂融合在能量代謝和細胞存活中具有重要作用[12]。且人重組DCN能夠抑制胰腺癌細胞的生長[13]。然而，胰腺癌中DCN的表達變化及DCN對胰島細胞線粒體的分裂、融合的影響目前尚未見報道。

本研究證明了PDAC和PNET患者癌組織中DCN表達水平明顯降低，并且，主要定位表達于胰島部位。因此，DCN可能與胰島β細胞的生長和功能密切相關。其次，通過檢測線粒體融合相關蛋白(MFN1、MFN2和OPA)和線粒體分裂相關蛋白(DRP1、FIS1和MFF)表達發現，PDAC和PNET患者胰島可能存在線粒體融合增加和線粒體分裂減少。這可能導致胰島細胞生長和功能受損，胰島素分泌不足，這與早期報道的MFN2抑制胰腺癌細胞的增殖和促進細胞凋亡結果一致[14-15]。MFN2將線粒體和內質網功能與胰島素信號傳導聯系在一起，對于正常的葡萄糖穩態是必不可少的[16]。本研究發現，DCN可促進胰島β細胞增殖，并在HG條件下，抑制胰島β細胞凋亡。同時，DCN在正常糖條件下促進線粒體分裂，抑制線粒體融合，而在HG條件下，DCN抑制線粒體分裂和線粒體融合。提示，DCN可能通過調控線粒體分裂融合影響胰島β細胞生長和胰島素釋放。在HG中，胰島β細胞呈現高度的胰島素抵抗、糖耐受和AKT表達水平下調。因此，DCN可能進一步下調HG環境線粒體分裂、融合。研究報道，DCN可調控P22phox/MAPK通路和IGFIR/AKT通路影響細胞生長和功能[5,17]。本研究結果顯示，在正常糖條件下，DCN上調胰島β細胞P22phox/MAPK通路和p-AKT表達，但不影響IGFIR表達。在HG條件下，DCN上調胰島β細胞P22phox/MAPK通路，但不影響IGFIR/AKT通路。說明，DCN具有調控胰島β細胞P22phox/MAPK通路介導線粒體分裂、融合的作用，繼而在正常糖和HG條件促進胰島β細胞增殖。提示，在胰腺癌中下調的DCN可能參與調控線粒體分裂、融合影響胰島β細胞功能，繼而影響胰腺癌的發生發展。

綜上所述，DCN低表達于PDAC和PNET患者胰島β細胞，且與胰島β細胞線粒體融合分裂失衡密切相關。DCN可激活P22phox/MAPK通路，調控線粒體分裂、融合參與胰島β細胞的胰島素分泌和細胞增殖。從蛋白水平可知，DCN促進正常糖條件下胰島β細胞的線粒體分裂并抑制融合，同時，DCN抑制HG條件下胰島β細胞的線粒體分裂、融合，且DCN對正常糖和HG條件下均激活P22phox/MAPK信號。但在HG條件下DCN介導的P22phox/MAPK通路激活如何同時影響調控胰島β細胞的線粒體分裂、融合尚需進一步研究。