環巴胺對良性前列腺增生大鼠Hedgehog通路相關因子的影響*

朱文雄，袁軼峰△，張 熙，劉 濤，李 博，陳其華

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院男科，湖南長沙 410007；2.湖南省第二人民醫院，湖南長沙 410007)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是指1組由前列腺細胞增生為實質改變而引起的癥候群。BPH為引起中老年男性排尿障礙原因中最為常見的1種良性疾病[1]。其病理學特點為前列腺上皮與間質細胞的過度增生，前列腺體積增大，當引起臨床癥狀時則稱為臨床BPH。據1組國外尸解資料報告顯示，80.1% 40歲以上男性，90.5% 80歲以上男性有組織學BPH。關于臨床BPH的發病率，國內有報告稱60～69歲的男性有中到重度癥狀者達到了60%[2]。BPH的主要臨床表現為尿頻、尿急、排尿躊躇、排尿費力、尿線變低、尿流無力、尿末滴瀝、排尿時間延長，嚴重時出現尿潴留及急迫性或充溢性尿失禁等。此外，還可繼發血尿、泌尿系感染、膀胱結石及上尿路積水和腎功能損害等嚴重合并癥。因此，尋找1種對BPH行之有效的藥物對維護中老年患者的健康及提高其生活質量具有重要意義。新近研究發現Hedgehog通路在胚胎發育、干細胞自穩態、細胞分化、組織極化和細胞增殖等過程起著非常重要的調控作用，眾多增生性疾病、腫瘤發生都與該通路的異常密切相關。環巴胺是1種強大的Hedgehog通路阻斷劑，該化合物在前列腺癌治療中的地位越來越高，但其對BPH的干預作用尚不明確[3]。本研究旨在探究環巴胺對BPH大鼠Hedgehog通路相關因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

成年雄性SD大鼠，體重400～450 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(湘)2019-0006。

1.2 主要試劑與儀器

環巴胺購自以色列Fermentek公司。丙酸睪酮購自襄陽華中藥業股份有限公司。二甲苯購自上海明投工貿有限公司。蘇木素購自上海盈公試劑有限公司。胎牛血清(FBS)購自上海依科賽生物制品有限公司。3，3-二氨基聯苯胺購自北京博奧森生物技術有限公司。碘化丙啶(PI)購自美國Sigma公司。鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液購自北京中山生物技術有限公司。細胞裂解液購自上海遠慕生物科技有限公司。ECL超敏發光液購自美國Biomiga公司。Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Biovision公司。TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer購自美國Applied Biosystems公司。BCA試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。Ki67單克隆抗體購自南京巴傲得生物科技有限公司。多克隆抗體Shh、Gli1、Ptc1、b-FGF、TGF-β、Bax、Bcl-2、GAPDH，小鼠抗羊IgG二抗購自美國Abcam公司。光學顯微鏡購自深圳博視達光學儀器有限公司。流式細胞儀CytoFLEX購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 BPH大鼠模型的構建[4]

先按劑量40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉的方式進行麻醉，對大鼠皮膚進行消毒，在無菌環境下經陰囊摘除雙側睪丸。術后大鼠恢復7 d，于第8天選取已去勢且狀態恢復較好的模型大鼠，每天按劑量4 mg/kg皮下注射丙酸睪酮(將丙酸睪酮溶于植物油中)，持續30 d。造模成功的評價標準：穿刺獲取前列腺組織，光鏡下可見整個前列腺腺腔充滿增生的腺上皮細胞，腺上皮細胞及間質組織出現了不同程度的增生。

1.4 分組、給藥與標本獲取

將造模成功的30只BPH大鼠隨機分為模型組(BPH組)和環巴胺組，未造模的15只大鼠作為正常對照組(Normal組)。環巴胺組大鼠按劑量50 mL/kg腹腔注射10 μmol/L環巴胺，1次/天，連續7 d；Normal組和BPH組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水，1次/天，連續7 d。給藥結束后，CO2處死大鼠，獲得各組大鼠前列腺組織，對每組大鼠進行以下指標的測定。用分析天平測前列腺組織濕重，用容積法測各組大鼠前列腺體積，計算前列腺指數(PI)，PI =前列腺濕重/體積。所有動物實驗均經過相關倫理委員會的批準。

1.5 前列腺細胞的提取、培養

取大鼠的前列腺組織，前列腺每葉各取部分，D-Hanks液清洗2次后剪碎，去除肉眼可見的大血管組織，用2%胰蛋白酶室溫消化前列腺各葉30 min，離心后用0.06% Ⅱ型膠原酶室溫消化15 min，過濾，取濾液加細胞培養液混勻，接種于包被有纖維連接蛋白的培養瓶內，置于5% CO2、37 ℃培養箱內培養。每48～72 小時換液1次。培養液為細胞培養液，加入10%胎牛血清，添加體積比為1∶100的胰島素-轉鐵蛋白-硒添加物、0.5 μg/L β-內皮細胞生長因子(ECGF)、1×105U/L青霉素和鏈霉素雙抗。取前列腺移動帶組織按上述方法處理，提取培養前列腺間質細胞。

1.6 免疫組織化學法檢測各組大鼠前列腺組織中增殖因子Ki67蛋白表達陽性率

取甲醛固定標本，石蠟包埋，連續4 μm厚切片。將組織切片放入60 ℃溫箱烘1 h，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，將切片放入3% H2O2中10 min，蒸餾水洗滌切片，每次3 min，共3次。高壓抗原修復90 s，涼水中冷卻到室溫，用PBS洗滌切片，每次3 min，共3次。滴加5% 牛血清清蛋白(BSA)，37 ℃孵育30 min。取出切片，將其擦干，滴加Ki67單克隆抗體(1∶200)，4 ℃下孵育過夜。之后取出切片，PBS洗滌切片，每次3 min，共3次。滴加含有生物素標記的小鼠抗羊IgG二抗(1∶1 000)工作液，37 ℃孵育30 min。取出切片，PBS洗滌切片，每次3 min，共3次。滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃孵育30 min。取出切片，PBS洗滌切片，每次5 min，共3次。3，3-二氨基聯苯胺(DAB)室溫顯色。在鏡下控制反應時間，使用自來水沖洗中止反應。當所有切片均顯色后，將其擺放在切片架上，在蒸餾水中浸泡5 min。切片架浸入蘇木素染色5 min后，在自來水下沖洗。取出切片架，1%鹽酸乙醇中浸洗4 s，自來水返藍20 min。PBS代替一抗作為陰性對照，已知的陽性切片作為陽性對照。染色分為陽性和陰性2種結果，以細胞質及細胞核內出現棕黃色顆粒狀著色判斷為陽性，以細胞質及細胞核內無棕黃色顆粒狀著色判斷為陰性。光學顯微鏡下觀察并攝片：每張切片選取5個高倍鏡視野(200×)，每個視野數100個細胞，陽性細胞占比小于10%為陰性，陽性細胞占比在10%～<50%為陽性，陽性細胞占比大于50%為強陽性。

1.7 流式細胞術分析細胞周期和細胞凋亡率

收集細胞，用0.25 %胰蛋白酶溶液消化，調整細胞數為1×106/mL，取1 mL細胞液1 500 r/min離心10 min，棄上清液，收集細胞，加PBS 2 mL，再離心，棄上清液后，用預冷的70%乙醇溶液固定細胞，4 ℃過夜。第2天將之前固定好的細胞用PBS洗滌2次，吸取細胞懸液100 μL (細胞不少于1×106/mL)，加入50 mg/L的PI染液(含RNAase) 1 mL，避光孵育30 min后，100目尼龍網過濾，流式細胞儀記錄激發波長在488 nm處紅色熒光檢測細胞周期。Annexin V-FITC/PI雙標染色檢測細胞凋亡，細胞處理方法與細胞周期檢測方法相同。置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，收集細胞，用PBS洗滌2次后離心將細胞重懸于200 μL結合緩沖液中，按照Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說明，按1∶2∶60比例將Annexin-V-FITC、PI、HEPES緩存液配成Annexin-V-FITC/PI染液。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300 μL HEPES，用流式細胞儀在激發波長488 nm處檢測HEPES細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.8 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測Hedgehog通路相關因子的表達水平

TRIzol法提取各組大鼠前列腺細胞總RNA，測定總RNA的濃度和純度。按照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer說明書進行反轉錄，反應體系20 μL，將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和無RNA酶水置于冰上溶解備用。設定反應條件為：42 ℃ 30～50 min (反轉錄反應)，85 ℃ 5 s (反轉錄酶失活反應)。上述反應獲得的cDNA中加入65 μL DEPC水稀釋，并充分混勻，按照以下組分配制PCR反應體系：5 μL SsoFast EvaGreen Supermix (2×)，0.5 μL 正向引物 (10 μmol/L)，0.5 μL 反向引物 (10 μmol/L)，4.0 μL cDNA。Shh、Ptc1、Gli1、成纖維因子(b-FGF)、轉化生長因子(TGF-β)、Bcl-2、Bax和GAPDH (GAPDH作為內參) PCR擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s；30個循環。各基因引物由華大基因有限公司合成，序列見表1。實驗重復3次。

表1 RT-qPCR引物序列

1.9 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Hedgehog通路相關蛋白的表達水平

取凍存于-80 ℃的前列腺組織80 mg (3組) 置于玻璃研磨器中加入1 mL RIPA裂解液[裂解液組成：50 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、150 mmol/L 氯化鈉(NaCl)、5 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)、1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、5 μg/mL 抗蛋白酶肽(Aprotinin)、2 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)]，置冰浴上研磨成勻漿；12 000 r/min 4 ℃低溫離心20 min，棄除脂層，取上清液采用BCA試劑盒測定每個樣品的蛋白濃度，樣品與加入上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min，冰浴、離心后用微量加樣器各泳道加入30 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，再將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉4 ℃封閉硝酸纖維素膜過夜。加入稀釋的一抗多克隆抗體Shh、Gli1、Ptc1、b-FGF、TGF-β、Bax、Bcl-2、 GAPDH(1∶1 000、1∶1 500、1∶1 500、1∶200、1∶2 000、1∶2 000、1∶500、1∶2 500) 4 ℃孵育過夜；次日室溫下TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗單克隆抗體IgG (1∶200)孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，添加ECL在暗室中顯影、定影。使用凝膠分析軟件BandScan 5.0對內參條帶和目的條帶進行灰度值檢測。細胞蛋白收集步驟：轉染48 h后收集細胞加入100 μL RIPA裂解液，冰浴30 min，12 000 r/min 4 ℃低溫離心20 min收集上清液，后續蛋白定量與電泳實驗步驟同上。實驗重復3次。

1.10統計學處理

2 結 果

2.1 免疫組織化學法測Ki67蛋白表達情況

免疫組織化學結果顯示，與Normal組比較，BPH組和環巴胺組Ki-67蛋白表達水平明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與BPH組比較，環巴胺組Ki-67蛋白表達水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 流式細胞術檢測細胞周期與凋亡情況

PI單染色法結果：與Normal組比較，BPH組和環巴胺組G0/G1期細胞比例明顯減少，S期細胞比例明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)；與BPH組比較，環巴胺組G0/G1期細胞比例明顯增多，S期細胞比例明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI雙標染色法檢測結果所示：與Normal組比較，BPH組和環巴胺組細胞凋亡率均有明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與BPH組比較，環巴胺組細胞凋亡率明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A：Ki67蛋白免疫組織化學染色(×400)；B：免疫組織化學定量分析；a：P<0.05，與Normal組比較；b：P<0.05，與BPH組比較。

A：細胞周期圖；B：細胞周期分析圖；C：細胞凋亡圖；D：細胞凋亡分析圖；a：P<0.05，與Normal組比較；b：P<0.05，與BPH組比較。

2.3 各組大鼠Shh、Ptc1、Gli1、b-FGF、TGF-β、Bax、Bcl-2 mRNA的表達水平

RT-qPCR檢測顯示，與Normal組比較，BPH組和環巴胺組Shh、Ptc1、Gli1、TGF-β、b-FGF、Bcl-2 mRNA表達水平明顯上升，Bax mRNA表達水平明顯下降，差異有統計學意義(均P<0.05)；與BPH組比較，環巴胺組Shh、Ptc1、Gli1、TGF-β、b-FGF、Bcl-2 mRNA表達水平明顯下降，Bax mRNA表達水平明顯上升，差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖3。

a：P<0.05，與Normal組比較；b：P<0.05，與BPH組比較。

2.4 各組大鼠Shh、Ptc1、Gli1、b-FGF、TGF-β、Bax、Bcl-2蛋白的表達水平

Western blot結果顯示，與Normal組比較，BPH組和環巴胺組信號通路因子Shh、Ptc1、Gli1、TGF-β、b-FGF、Bcl-2蛋白表達水平明顯上升，Bax蛋白表達水平明顯下降，差異有統計學意義(均P<0.05)；與BPH組比較，環巴胺組信號通路因子Shh、Ptc1、Gli1、TGF-β、b-FGF、Bcl-2蛋白表達水平明顯下降，Bax蛋白表達水平明顯上升，差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖4。

A:Western blot分析圖；B:Western blot圖;a：P<0.05，與Normal組比較；b：P<0.05，與BPH組比較。

3 結 論

BPH是前列腺上皮與間質細胞的過度增殖性疾病，其發生的具體機制尚不明確，隨著人類研究的不斷深入，生長因子與細胞凋亡這兩大方面越來越得到大家的關注，BPH很可能就是由于上皮和間質細胞的增殖和細胞凋亡的平衡遭到破壞所引起[5]。故以調控細胞增殖與凋亡為干預靶點或可為防治BPH提供新的治療途徑。近年來，研究發現分泌蛋白Hedgehog家族成員在脊椎動物和非脊椎動物的發育中起著至關重要的調控作用，包括細胞增殖、分化和組織的形成等[6]。如果Hedgehog通路失調，會引起多種增生性疾病、先天畸形、惡性腫瘤、肥胖癥等。脊椎動物體內發現了3種Hedgehog家族的成員：Shh、Dhh和Ihh，其中Shh信號通路的作用最廣泛，對人類而言最為主要[7]。很多研究發現，Shh及其信號傳導系統中的分子在增生前列腺組織中呈高表達[8]。在前列腺細胞的生長中，Hedgehog通路已經被證明是正調節劑和增殖刺激物。

Hedgehog信號通路由分泌型糖蛋白(Hh)配體、2種主要的膜蛋白受體，即Ptc(patched)和Smo(smoothened)、核轉錄因子Gli(Glioma)和下游靶基因4部分組成，通過1條復雜的信號轉導級聯反應來執行它的生物學功能[9-10]。在脊椎動物的Shh、Dhh和Ihh 3個同源基因可以編碼類似的分泌蛋白即Hh配體，其本身并不具有活性，但可以通過自身催化加工的能力經修飾后產生生物學活性。Hh配體活化后，原本與Smo結合以抑制Smo活性的Ptc與Hh配體結合，Ptc-Smo復合物解離，Smo進入細胞內。Ptc是1種12次跨膜蛋白，有2個細胞外結合域和1個細胞內結合域，其可分為Ptc1和Ptc2 2個亞型。環巴胺可以與Ptc競爭性地結合Smo，從而抑制Smo的活性。Smo蛋白是具有7個疏水跨膜區的信號轉導蛋白，激活的Smo可以將信號向下傳導，激活Hedgeho信號通路的核心部位——含鋅指結構的核轉錄因子，即Gli，包括Gli1、Gli2和Gli3，隨后Gli進入細胞核并啟動下游目標基因的表達。在沒有Hh配體參與的情況下，Ptc與Smo結合并抑制Smo的活性，核轉錄因子Gli家族的Gli2、Gli3處于無活性的GliR復合體形式，而Gli1的活性形式Gli1A則被Sufu蛋白所抑制，需要經過磷酸化后表現出相應的生物學活性[11-14]。在Hedgehog信號通路中，Hh配體、Smo、Gli作為激動因子發揮正調節作用，而Ptc作為抑制因子發揮負調節作用。在激活轉錄因子Gli基因家族后，Hh可以調控VEGF、c-myc、Wnt、TGF-β、Bcl-2、Bcl-x等靶基因的表達，維持胚胎的發育、促進自我更新、血管生成、細胞增殖等多種生物學功能[15-17]。

研究結果顯示，環巴胺能夠降低BPH大鼠Ki67蛋白陽性表達率。Ki67蛋白已被作為診斷和評估正常前列腺組織、前列腺上皮內瘤樣病變和前列腺腫瘤患者中細胞增殖活性的有用和有效工具[18]。其與細胞周期的增殖相關，其過度表達可能牽涉前列腺細胞數量的增加。環巴胺可以降低Ki67蛋白的表達。環巴胺能夠抑制細胞增殖，使細胞阻滯在G0/G1期，并能促進前列腺上皮細胞的凋亡，從而減少上皮細胞的數目。本研究發現，與Normal組大鼠比較，BPH模型大鼠Shh，Ptc1，Gli1，b-FGF，TGF-β和Bcl-2的mRNA及蛋白表達水平明顯增加，而Bax的mRNA及蛋白表達水平明顯下降，表明了激活的Hedgehog通路可使細胞增殖增加和細胞凋亡減少。這與環巴胺的治療使Hedgehog通路的激活被抑制，細胞增殖受抑制且細胞凋亡增強的結論一致。Shh、Ptc1、Gli1是Hedgehog通路中的3個關鍵成員，其表達對BPH的發展產生重要影響。成纖維因子b-FGF和TGF-β可誘導和促進BPH的上皮細胞增殖。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族，前者是抗凋亡成員，后者是促凋亡成員。環巴胺可以有效阻斷Hedgehog通路，下調b-FGF、TGF-β和Bcl-2的表達，增加Bax的表達，導致前列腺細胞增殖減少，細胞凋亡增加，BPH進展受到抑制。

總之，本研究提供的證據表明環巴胺通過阻斷Hedgehog通路，減少前列腺細胞和增殖并促進前列腺細胞凋亡，從而能夠有效抑制BPH的進展。未來可以進一步研究環巴胺阻斷Hedgehog通路干預BPH進展的具體機制，并探討其治療BPH的臨床價值。