亞精胺參與雜草對聯吡啶類除草劑抗性機制的研究進展

閆 甜,沈雪峰

(1.廣東海洋大學教育信息中心,廣東湛江 524088; 2.廣東海洋大學濱海農業學院,廣東湛江 524088)

農田草害是農業生產的主要生物災害之一。然而,在長期使用化學除草劑的作用下,目前已報道蘇門白酒草等30多種對聯吡啶類(如百草枯等)除草劑產生了抗藥性生物型雜草?？顾幮陨镄碗s草群體的危害日益嚴重,給當地農業生產和雜草防控造成了巨大的負擔[1]。亞精胺廣泛分布于生物體中,參與多種細胞活動,在增強植物抗性方面發揮著重要作用。因此,本文通過探討亞精胺與聯吡啶類除草劑的相互關系,分析多胺及其轉運體與聯吡啶類除草劑的相互關系,揭示亞精胺是聯吡啶類除草劑抗性研究的一個重要方向,為進一步明確雜草對聯吡啶類除草劑抗性機制及綜合治理提供參考。

1 亞精胺

亞精胺(spermidine,Spd),別稱精瞇,是由腐胺和腺苷甲硫氨酸生物合成的一種多胺。其化學名稱為N-(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺,化學式為C7H22N3。它廣泛分布于生物體中,參與多種細胞活動過程,包括轉錄、RNA修飾、翻譯、膜的穩定性以及調節細胞信號傳導等[2],還控制著各種陽離子通道的活性[3],與植物生長發育密切相關,可以促進植物生長發育,延緩衰老,提高抗逆性[4-5]。

1.1 生物合成與分解代謝

多胺(polyamines,PAs)是生物代謝過程中產生的一類具有生物活性的低分子脂肪族含氮堿[6],除了亞精胺外,還包括腐胺(putrescine,Put)、精胺(spermine,Spm)、鯡精胺(agmatine,Agm)等,另外還有降精胺(norspermine,Nspm)、降亞精胺(norspermidine,Nspd)、高精胺(highspermine,Hspm)、高亞精胺(homospermidine,Hspd)和熱精胺(thermospermine,Tspm)等稀有多胺[7]。它們不僅參與了植物的各種生長發育過程,還與其衰老及抗逆性都有密切關系[8-9]。

亞精胺是由腐胺在亞精胺合成酶(spermidine syathase,SPDS)的催化下得到的,可經精胺合成酶(spermine synthase,SPMS)催化生成精胺,也可經熱精胺合成酶(ACL5)催化生成熱精胺[7]。多胺氧化酶(polyamine oxidase,PAO)和二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)的氧化作用可以實現多胺的分解代謝。其中,PAO在單子葉植物中含量較高,而DAO在雙子葉植物中含量較高[8]。PAO有多個家族,它們可以氧化多胺生成代謝終產物,也可催化多胺合成的逆反應。小麥PAO可以催化亞精胺和精胺氧化分解,分別生成 4-氨基正丁醛或3-氨丙基-4-氨基正丁醛,同時生成1,3-丙二胺和H2O2[10]。擬南芥PAO1和PAO4,類似于哺乳動物精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO),催化精胺生成亞精胺,擬南芥PAO3可以催化精胺生成亞精胺,再生成腐胺。

1.2 在植物體內的作用

1.2.1 保護細胞膜 多胺可以和膜蛋白結合,從而保持細胞膜的完整及穩定,此外還具有平衡細胞分子組分和結構的功能。研究顯示,噴施外源亞精胺后,玉米幼苗的細胞膜流動性降低,抑制水分脅迫下膜透性增加,阻止細胞內物質的滲透[11];在谷氨酰胺酶的作用下可以結合到紅細胞膜蛋白中谷氨酸殘基的羧基上,磷脂分子與蛋白分子發生交聯,有穩定質膜結構的作用。

1.2.2 清除活性氧自由基 植物在長期的生長進化過程中形成了一整套非常高效的抗氧化系統來保護細胞,包括酶促反映系統和非酶促反映系統,負責清除植物體內的活性氧,使生物體中活性氧的產生和清除處于動態平衡中,但當植物受到外在條件脅迫時,系統清除活性氧的能力減弱,所以活性氧的動態平衡就會破壞,植物體內活性氧積累,使細胞膜質過氧化,膜功能受損,導致植物無法正常生長。

研究顯示,外源亞精胺對環境脅迫下的植物具有保護作用,有助于提高植物對多種脅迫的耐受力,亞精胺與植物逆境脅迫抗性的關系最為密切[12]。外源亞精胺能減輕各種脅迫對植物的傷害,主要是因為亞精胺能夠增強植物體內抗氧酶的活性,清除植物體內過多的自由基。外源亞精胺具有增強黃果柑果實抗氧化保護系統的能力,通過調控黃果柑果實抗氧化酶活性,來提高植株的防御能力[13];能夠降低NaCl脅迫下黃瓜幼苗的活性氧、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)和過氧化氫的含量[14],增強過氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性,來降低NaCl對植株的傷害[15];也可延緩光下玉米離體葉片衰老過程中CAT、POD、SOD活性下降,阻止MDA的累積,表明亞精胺延緩衰老與其維持消除自由基的能力有關。此外,亞精胺還可阻止可溶性蛋白和葉綠素的降解。

1.2.3 對胚胎發育的促進作用 亞精胺是細胞生長、分化和死亡的關鍵性調節者,同時還是DNA、RNA和生物膜的穩定因子,還可以作為抗氧化劑、營養素以及第二信使[16-17]。亞精胺是由亞精胺合成酶(SPDS)催化腐胺生成的,擬南芥中有2個亞精胺合成酶基因,當這2個基因中任何一個發生突變后植物可以正常生長,但是當這2個基因同時發生突變時會導致胚胎死亡,說明亞精胺合成酶在植物體胚胎發育中起著重要作用。研究表明,當把亞精胺合成酶基因轉入到作物體內可使其亞精胺含量升高,使植物抗脅迫能力提高[18]。

1.2.4 與生物大分子作用 亞精胺可以調節復制、轉錄、翻譯過程,通過亞氨基和氨基與DNA雙螺旋上的磷酸基團結合,中和DNA分子中磷酸基團的負電荷,還可以提高DNA分子對酶和熱的抵抗力,穩定DNA的二級結構。

2 聯吡啶類除草劑

2.1 聯吡啶類除草劑性質

聯吡啶類化合物作為除草劑始于20世紀50年代中期,屬于非選擇性觸殺性除草劑,其代表性產品為敵草快、百草枯[19]。聯吡啶類除草劑是 PSⅠ 抑制劑,它們進入植物細胞后,截斷PSⅠ及NADH2與NADPH2氧化的電子,而其本身的陽離子在攔截電子后被還原成自由基,在氧的參與下形成過氧化物,可使生物膜中的未飽和脂肪酸產生過氧化作用,最后造成細胞迅速死亡[20]。這類化合物的化學結構與其除草劑活性有關,聯結2個氮原子的C為2個時,即2,2′-聯吡啶的活性最高;C鏈為“3,4-”時,活性顯著下降,3,3′-甲基取代時,化合物無活性。這類除草劑在植物體內通過電子還原產生游離基,然后進行氧化反應產生過氧化物,從而對植物產生毒害來發揮它的作用,在陰天黑暗或缺氧環境下其活性顯著下降,聯吡啶類除草劑對光合作用的抑制作用是通過分流光合電子傳遞鏈的電子和抑制光合磷酸化2種途徑實現的。

2.2 聯吡啶類除草劑的田間生物行為

聯吡啶類除草劑對闊葉雜草有很強的防治清除能力,用在作物播種前后,出苗前滅殺已長出的雜草,或者在作物苗長大后定向噴施。有些聯吡啶類除草劑如敵草快是一種接觸性干燥劑,可以用作催枯劑和種子干燥劑。聯吡啶類除草劑會受天氣條件影響,但與其他除草劑相比,聯吡啶類除草劑對天氣條件的影響不是很敏感。

2.3 雜草對聯吡啶類除草劑的抗性遺傳

長期大面積使用除草劑會使雜草對除草劑產生抗性,如今已有大量關于抗性遺傳事例的報道。用敵草快處理抗敵草快的南非金盞草(Arctothecacalendula)種群和其敏感種群的雜交F1代,用百草枯處理大麥草抗性和敏感種群的雜交F1代,F1代都僅表現出中等抗性,它們的F2代分離比都和預測的分離比1 ∶2 ∶1(抗性 ∶中抗 ∶敏感)相吻合,南非金盞草種群F1代與敏感種群回交的分離比為1 ∶1(中抗 ∶敏感)。這些結果證明,有1個不完全顯性基因控制著這2種雜草對聯吡啶類除草劑的抗性。這種顯性或半顯性抗性存在抗性頻率迅速增加的潛能和風險[21]。2009年Wakelin等的研究[22]也證實了這一觀點。同種或同屬不同種百草枯的抗性和敏感型植株間可進行雌雄同株或異株的雜交,隨花粉的移動傳播抗性等位基因,增加除草劑抗性的進化效率[23]。

3 亞精胺對聯吡啶類除草劑靶標雜草抗藥性的作用機制

3.1 亞精胺與聯吡啶類除草劑的相互關系

亞精胺與聯吡啶類化合物在化學性質上具有一定的相似性,其中敵草快和百草枯是季銨鹽類化合物,亞精胺為三胺鹽類化合物,同時亞精胺與聯吡啶類化合物具有非極性結構,空間位阻小,氮原子周圍帶最大正電荷等特征(圖1)。由于亞精胺轉運體對底物分子的結構要求不嚴格,使得聯吡啶類化合物能夠與其共用同一轉運體[24-25]。所以,當植物體內存在大量聯吡啶類化合物時,在細胞膜上可與亞精胺競爭轉運體蛋白載體的結合位點而被細胞攝取,而在施加外源亞精胺條件下,亞精胺又可以競爭抑制聯吡啶類化合物的吸收位點[26]。

3.2 亞精胺對聯吡啶類除草劑毒性的緩解作用

亞精胺能夠在一定程度上降低百草枯對植物的毒性,緩解百草枯產生的藥害。經百草枯處理可以增加水稻(OryzasativaL.)體內腐胺的濃度,降低亞精胺和精胺的濃度;而經亞精胺黑暗處理離體水稻葉片6 h后,水稻體內亞精胺含量增加了10倍,使25 μmol/L百草枯水劑的傷害作用降低了30%,表明亞精胺能夠降低百草枯在水稻葉片和細胞中轉運,降低百草枯的毒性[27]。Kim等用1 mmol/L亞精胺預處理蘿卜(RaphanussativusL.)子葉,發現其可以顯著提高蘿卜對50 μmol/L百草枯水劑的耐受能力[28]。用100 μmol/L百草枯水劑處理向日葵(HelianthusannuusL.)葉盤,發現百草枯可以抑制腐胺合成酶——精氨酸脫羧酶(arginase decarboxylase,ADC)和鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)的活性,降低向日葵葉盤中腐胺、精胺和亞精胺的含量;而外施亞精胺能夠減輕百草枯對植株的傷害,恢復百草枯對SOD活性的影響[29]。Soar等通過測定抗藥性和敏感生物型賽金盞(ArctothecacalendulaL.)體內多胺的含量,發現在抗藥性生物型賽金盞體內腐胺和亞精胺的含量高于敏感生物型植株,而施用外源亞精胺處理敏感生物型賽金盞能有效降低植株體內百草枯的含量,增強植株對百草枯的抗性[30]。最新的研究也表明,植物體內亞精胺轉運體在百草枯抗性產生過程中發揮著重要作用[31]。

3.3 多胺及其轉運體與聯吡啶類除草劑的相互關系

早期的研究顯示,腐胺、精胺等多胺類物質能夠通過細胞膜上轉運體的作用,競爭性抑制植物對聯吡啶類除草劑的吸收,減輕聯吡啶類除草劑對細胞的損害,后來研究發現,這類轉運體的天然底物即是多胺類物質,故這類轉運體又被稱為多胺轉運體[24-25]。通過對玉米(ZeamaysL.)幼苗根部對百草枯、多胺[腐胺、尸胺(cadaverine,Cad)和精胺]吸收量的測定,發現百草枯和腐胺的濃度依賴性動力學是相似的,其動力學曲線顯示,在低濃度下,玉米幼苗根部對百草枯和腐胺的吸收均呈直線上升狀態,直至飽和,競爭試驗結果表明,在飽和濃度下的玉米根部和幼苗中,腐胺可能通過競爭而抑制百草枯的吸收[32]。Jung等的研究結果表明,在原核生物如大腸桿菌中,多胺能夠降低百草枯的傷害作用[33]。Kashiwagi等的研究表明,微生物中多胺轉運蛋白是多胺特異性或多胺優先性轉運蛋白[34]。大腸桿菌的多胺轉運系統包括2個ATP結合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉運蛋白,并且這2個蛋白具有對腐胺和亞精胺特異的選擇性[35]。

轉運體是生物體內一類跨膜蛋白,主要參與離子以及一些小分子的吸收、轉運和隔離。在原核和真核生物細胞的原生質體、液泡和線粒體中,都存在著大量轉運體,如PrqA、PotE、EmrE、MvrA和CAT4等,它們以能量轉運的方式主動轉運并除去百草枯及大多數的其他毒性分子,以減少作用于靶標的藥物濃度[6,26]。百草枯能被腐胺和氨基酸陽離子轉運體所運輸,多胺轉運體在大腸桿菌和酵母等低等生物中對百草枯的抗性具有一定的作用,就其結構和功能而言,這些轉運體都能夠參與百草枯的轉運、隔離,在雜草對百草枯抗性機制中起著重要作用[19]。郭書巧等從被百草枯污染的環境中分離得到抗百草枯的細菌——硝基還原假單胞菌(Pseudomonasnitroreducens)和人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi),并分別從中克隆了PnPQR和OaPQR基因,發現它們同屬于轉運體家族中主要的易化超家族(major facilitator superfamily,MFS)成員[36]。進一步對其進行原核表達和植物轉基因研究,結果表明,二者均可使大腸桿菌對百草枯產生抗性,同時也能賦予T0代轉基因煙草對百草枯的抗性[37]。Xi等通過篩選得到了1株擬南芥的抗性突變體pqt24-1,其T-DNA插入在基因Atlg66950第13個外顯子中,該基因編碼ATPDR11蛋白,屬于ABC轉運蛋白家族,該轉運蛋白負責質膜中約50%百草枯的吸收,敲除該轉運蛋白的基因則可降低細胞對百草枯的吸收量,從而使得相應的突變體具有較強的耐百草枯表型[38]。Fujita等發現RMV1的T-DNA突變體幼苗吸收百草枯速率降低了70%,這使突變體對百草枯的抗性提升了2～4倍,而野生型轉入RMV1后對百草枯極度敏感[39]。最近又有2個與百草枯轉運相關的擬南芥基因被報道,分別是At1g66950和At1g13830。其中,At1g66950編碼的AtPDR11蛋白是ATP結合盒轉運體超家族的一員,定位于細胞膜上。At1g66950的T-DNA插入突變體幼苗對百草枯的吸收量比對照減少了一半,導致其對百草枯的抗性提升了近2倍,而且At1g66950的轉錄水平受到百草枯的強烈誘導,這都表明AtPDR11可能是百草枯轉運體[38]。另有報道指出,擬南芥抗百草枯突變體par1的At1g31830基因發生突變后,百草枯從體外進入體內的速率與野生型相比并無明顯改變,但突變體葉綠體中百草枯積累量明顯減少,而且At1g31830編碼的蛋白亞細胞定位于高爾基體上,這說明其參與了將百草枯在細胞內轉運至葉綠體的過程;在水稻中鑒定出了At1g31830同源基因——OsPAR1,超表達該基因會引起水稻對百草枯的超敏性,而RNAi干擾OsPAR1基因表達的水稻轉基因株系對百草枯產生了抗性[40]。此外,在細菌中也發現了百草枯轉運相關基因,有報道指出人蒼白桿菌中存在1個編碼膜轉運體蛋白的抗百草枯基因PqrA,將其轉入煙草中,可使轉基因煙草對百草枯產生抗性[41]。

4 展望

由于植物對聯吡啶類除草劑的抗性是受多因素調控的復雜過程,其抗性作用機制存在幾種假說,而具體的作用機制尚不十分清楚。近年來,大量試驗將百草枯的抗性機制集中到多胺及其轉運體上,已有數據顯示百草枯的進入和亞精胺的變化存在相關性(數據尚未發表),極有可能亞精胺和百草枯通過爭奪電子而競爭葉綠體上的位點,以及亞精胺轉運體參與了百草枯的轉運,但這也是假設。因此,亞精胺及其轉運體對百草枯的運輸機制、抗性作用以及生理生化功能、代謝差異、基因克隆與表達、抗性材料的遺傳轉化等將是今后聯吡啶類除草劑抗性研究的重要領域。