產香真菌的鑒定及揮發性成分分析

范露，李嬋娟，闕鳳，董夢瑩

(1.武漢設計工程學院 食品與生物科技學院，武漢 430205；2.湖北工業大學 生物工程與食品學院，武漢 430068)

香精、香料的應用非常廣泛，特別是在食品加工、化妝品研發、化工和制藥工業等方面都是必不可少的[1]。目前天然香精、香料的獲得方法主要有以下幾個方面：從植物中直接提取，培養植物細胞進一步提取，酶合成法以及通過微生物發酵來獲得[2]。其中，通過微生物發酵來獲取這一方法最受人們的關注，因為微生物能高效利用天然原料進行催化合成大量的天然香料產物[3]。而想要利用微生物發酵來生產天然香精、香料，最關鍵的問題就在于首先要獲得一株生產性能良好的菌株[4]。微生物可通過直接生物合成和生物轉化兩種途徑發酵合成各種天然香氣成分，而真菌是合成生產天然揮發性香氣物質的重要資源之一[5-6]。

產香微生物在工業生產中應用非常廣泛，如在煙用香料[7]、白酒[8]、茶葉[9]、饅頭[10]、泡菜[11]、醬油[12]、醋[13]、豆瓣醬[14]、發酵辣椒[15]等產品中應用較多，采用微生物發酵法獲得香味成分具有產香菌生長迅速且易于進行基因工程改造優化等優點,受到越來越多的重視和開發，而這些研究的關鍵在于獲得生產性能好的菌株，因此對于產香功能性微生物的篩選鑒定、致香成分分析等研究具有較高的理論和應用價值，為其應用領域的進一步拓寬提供了依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

土豆：市售；菌株3-7、5-3、5-8：由本實驗室前期從土壤中分離保存；瓊脂糖、TAE、蝸牛酶、蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂、PCR試劑：均為生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；真菌DNA提取試劑盒、上樣緩沖液、λ-DNA-Hind Ⅲ Marker和溴化乙錠：中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

DNR Bio-Imaging Systems B1S910型凝膠成像儀；Agilent 7890B-7000C型氣質聯用儀；SPX-430型生化培養箱 寧波江南儀器廠；JJ-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；10-B7579型滅菌鍋 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 形態鑒定

將3株菌株分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)上，用封口膜進行密封，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，觀察菌落形態和個體形態。同時分別取每株菌株1 mL的菌液加到2 mL的離心管中，再向離心管中加入500 μL的甘油，在121 ℃的條件下滅菌20 min進行甘油保菌，便于后續試驗的進行。每天在固定時間段測量菌落半徑。用接種針在菌落上挑取部分菌體，在顯微鏡下進行觀察。

1.3.2 分子鑒定

將3株菌株接種到含有10 mL的酵母膏葡萄糖瓊脂液體培養基的50 mL離心管中，于28 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養3 d。用移液槍和1 mL的離心管小心地吸取在50 mL離心管底部的菌體，每次吸取體積為1 mL，放入1.5 mL的離心管中。將含有菌體的離心管放入離心機中在12000 r/min的條件下離心1 min。小心吸取上清部分，盡量將培養基全部吸出。重復以上步驟3次，再取100 μL濃度為0.2 mg/mL的蝸牛酶加入離心管中，為了防止蝸牛酶降解，再加入10 μL濃度為0.05 g/mL的EDTA。將加入上述試劑的離心管置于45 ℃的水浴鍋中反應1 h。將提取到的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像儀觀察判定DNA提取是否成功。將擴增后DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，通過在凝膠成像儀下判定是否擴增成功，成功擴增后將得到的DNA進行BLAST分析。

1.3.3 發酵揮發性成分萃取及鑒定

采用頂空萃取揮發性成分后進行GC-MS分析，同時以不接種的培養基作為空白對照。色譜條件：色譜柱DB-5(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度300 ℃，分流比50∶1，進樣量1 μL，初始溫度35 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持0 min，以20 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。質譜條件：EI離子源，傳輸線溫度300 ℃，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃。采用面積歸一化法進行定量。

2 結果與分析

2.1 產香菌株的鑒定

2.1.1 形態鑒定

菌株3-7在PDA培養基上的形態見圖1。

(1)培養1 d (2)培養5 d (3)鏡檢(1000×)

由圖1可知，28 ℃下恒溫培養3 d后，菌落直徑可達70～74 mm，菌絲密集，呈絨毛狀向四周蔓延，邊緣均勻，表面不光滑，中間有凸起，菌絲呈白色；顯微鏡下可以觀察出為有隔菌絲；分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，分生孢子頭呈掃把狀，分生孢子直徑約為3 μm。

菌株5-3在PDA培養基上的形態見圖2。

(1)培養1 d (2)培養5 d (3)鏡檢(400×)

由圖2可知，28 ℃下恒溫培養3 d后，菌落直徑可達8～10 mm，表面平滑，邊緣光滑，菌落為乳白色，顏色均一，表面濕潤有光澤，黏稠易挑起；菌體呈卵圓形；繁殖方式為多邊出芽，細胞直徑約為3 μm。

菌株5-8在PDA培養基上的形態見圖3。

(1)培養1 d (2)培養5 d (3)鏡檢(1000×)

由圖3可知，28 ℃的培養條件下恒溫培養3 d后，菌落直徑可達69～72 mm，菌絲密集，呈絨毛狀向四周蔓延，邊緣均勻，表面不光滑，中間有凸起，菌絲呈白色；顯微鏡下可以觀察出為有隔菌絲；分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，分生孢子頭呈掃把狀，分生孢子直徑約為3 μm。

2.1.2 分子鑒定

按照真菌DNA提取試劑盒上的操作步驟進行DNA的提取后，為了驗證是否成功提取到DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳結果在凝膠成像儀下進行觀察，所得結果見圖4。

圖4 DNA電泳結果Fig.4 The results of DNA electrophoresis

由圖4可觀察到拖帶現象，分析原因可能是含有蛋白質雜質，但也可以判斷出成功提取到菌株的DNA。將成功提取得到的DNA進行PCR擴增，為了驗證是否擴增成功進行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳結果在凝膠成像儀下進行觀察，所得結果見圖5。

圖5 PCR電泳結果Fig.5 The results of PCR electrophoresis

由圖5可清楚地觀察到PCR擴增結果較為成功，但條帶看起來稍有不清晰，可能的原因：一是染色時間不夠長，二是染色液濃度較低。

將3株菌株的ITS基因序列通過與NCBI的BLAST檢索系統對序列相似性進行分析比較，所得結果見表1。

表1 3株菌ITS基因序列與NCBI的BLAST檢索系統對序列相似性分析結果Table 1 The results of similarity analysis of sequence by ITS gene sequence and NCBI BLAST retrieval system of three strains

根據測序結果，菌株3-7、5-8的ITS序列與GenBank中的JQ668740.1序列相似程度最高(相似度為96.10%)，這兩株菌初步鑒定為白地霉(Galactomycesgeotrichum)。菌株5-3的ITS序列與GenBank中的NR_153279.1相似程度最高(相似度為100%)，初步鑒定為卡氏念珠菌(Candidacabralensis)，屬于假絲酵母屬。

2.2 菌株發酵揮發性成分分析

將試管斜面菌種接種到YPD液體培養基中，在28 ℃的條件下搖床振蕩培養3 d，然后采用頂空萃取揮發性成分后進行GC-MS分析，同時以不接種的培養基作為空白對照，結果見表2。

表2 各菌株主要揮發性成分Table 2 The main volatile components of each strain

續 表

由表2可知，相對含量大于0.1%和匹配度大于80%的成分，各菌株發酵代謝產物成分總數和種類均有所不同。菌株5-3經過發酵后，相較于空白對照，主要新產生了異丁醇、異戊醇、2,4-二甲基戊烷、N-甲基-N-亞硝基苯胺和苯乙醇等幾種成分，其中尤以苯乙醇(相對含量7.07%)和異戊醇(相對含量3.06%)居多，說明菌株5-3是一株代謝產醇能力較強的酵母，并且結合感官判斷，發酵產物醇香清新且不刺鼻，聞之非常愉悅；菌株3-7(5-8)代謝后產生了戊酸丁酯、丁酸戊酯、正戊酸正戊酯和苯乙醇等揮發性成分，其中以戊酸丁酯(相對含量2.06%)和苯乙醇(相對含量2.48%)為主，該菌株代謝過程中能產生酯類和醇類等揮發性成分，具有一定的產香能力。菌株代謝產生香氣成分與培養基的成分也存在密切關系，后續可作進一步研究。

3 結論

本文對3株產香菌株進行了形態鑒定和分子鑒定。通過菌株在PDA培養基上28 ℃恒溫培養，所觀察到的形態可以初步判定其中3-7和5-8為霉菌，5-3為酵母菌。為了進一步準確判定3株菌株的菌種類型，分別對3株菌株進行DNA的提取，再進行BLAST分析。根據BLAST分析所得到的結果可以判定3-7和5-8為同一種菌株，為一株白地霉菌，菌株5-3為假絲酵母。GC-MS檢測結果表明，菌株5-3是一株代謝產醇能力較強的酵母，發酵產物醇香愉悅；菌株3-7(5-8)代謝能產生一定量的酯類和醇類，具有一定的產香能力。該菌株在微生物發酵法來制取天然香精、香料方面有一定應用潛力。