傳統自然發酵醬油細菌群落結構特征分析

鄧岳，梁麗靜，遲原龍，孫群

(1.瀘州職業技術學院，四川 瀘州 646000；2.四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610064；3.四川大學 生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室，成都 610064)

醬油作為中國使用大豆為主要原料的傳統的發酵制品之一，因其獨特營養價值與風味品質而備受全球人民尤其是亞洲人民的喜愛，中國作為最早釀造醬油的國家之一，其釀造歷史可以追溯到周朝時期[1]。傳統醬油釀造過程中主要包括以曲霉發酵代謝活動為中心的制曲階段和以耐鹽性乳酸菌和耐鹽性酵母菌為中心的固液發酵階段，并且醬油中的重要特征風味物質，如乙醇、甘油和醇類物質以及芳香族化合物都在此階段生成，從而賦予醬油特殊的風味特征。在醬油固液發酵過程中，以耐鹽性乳酸菌和耐鹽性酵母菌為主的微生物對醬油色、香、味和體態的形成和品質起重要作用[2]。

目前，國內醬油釀造行業中工業生產醬油主要采用滬釀3.042作為發酵的工業菌種[3]，該菌種具有產酶能力強、生長快、抵抗污染能力較強等優點。但添加單一菌種制曲生產的醬油風味和口感遠不如傳統自然發酵醬油。傳統自然發酵醬油采用的是長周期開放式的釀造工藝，醬醅發酵過程涉及到多種有益微生物的聯合協同作用，通過微生物分解原料中的碳水化合物、蛋白質、脂肪等大分子化合物產生醇類、醛類、酸類、酯類、酚類等小分子風味物質，是醬油獨特產品風味形成的主要途徑[4]。因此，研究傳統發酵醬油中微生物多樣性對揭示醬油品質形成顯得尤為必要。

四川省瀘州市先市鎮的先市醬油，采用手工作坊式的天然多菌種混合發酵工藝，在自然環境中日曬夜露3～5年，所產醬油具有獨特風味和顯著的區域特色[5]。該釀造技藝于2014年被列入中國“非物質文化遺產”名錄進行重點保護，其生產場所也被列為“四川重點文物保護單位”名錄。本文擬對先市醬油釀造技藝過程中的細菌群落結構進行分析，為揭示傳統自然發酵過程中的細菌菌群結構和動態變化規律，傳統自然發酵釀造技藝調整，解釋傳統自然發酵醬油風味等品質形成和潛力菌株篩選提供了理論基礎。

1 材料與設備

1.1 樣品采集

樣品：由四川省瀘州市合江縣先市釀造食品有限公司提供，分別采自整個發酵過程中的第0.5，1，2，3，4年，具體取樣點和樣品命名見圖1。每個年份由3個隨機分布的醬缸中間位置取樣，樣品選擇遵循隨機原則，不同醬缸樣品經充分混合后，于4 ℃保存備用。

圖1 先市醬油生產工藝流程和試驗樣品取樣點Fig.1 The production process of Xianshi soy sauce and sampling points of test samples

1.2 主要試劑

FastPfu聚合酶：TransGen Biotech Co., Ltd.；2%瓊脂糖凝膠：Biowest公司；DNA抽提試劑盒(Omega-soil DNA kit)：Omega公司；Illumina MiSeq平臺：美國Illumina公司；其余試劑：均為分析純。

1.3 主要儀器設備

NanoDrop 2000超微量分光光度計 Thermo Fisher Scientific公司；ABI GeneAmp?9700型PCR儀；ABSON MiFly-6小型離心機；Eppendorf 5424R高速臺式冷凍離心機；DYY-6C電泳儀；Illumina MiSeq測序儀；BioTek ELx800酶標儀 美國BioTek公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司。

1.4 DNA 抽提和 PCR 擴增

采用 E.Z.N.A.?soil DNA kit (Omega BioTek, Norcross, GA, U.S.)提供的標準DNA提取方法，對傳統工藝發酵醬油中微生物群落總DNA進行抽提，并使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行質量檢測，并使用NanoDrop 2000對提取的測定DNA濃度和純度進行分析檢測。

1.5 PCR擴增

以傳統工藝發酵醬油中提取的基因組DNA作為模板，對該基因組的16S rDNA序列V3-V4區域進行擴增，使用的引物如下：

338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；

806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

DNA擴增程序：95 ℃預變性 3 min，27個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，72 ℃穩定延伸10 min，并置于4 ℃保存，每個樣本3個重復。

1.6 Illumina MiSeq測序

將傳統發酵醬油中同一樣本的PCR產物混合后，進行PCR產物回收與純化、檢測定量后，使用Illumina公司的MiSeq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序。

1.7 數據處理

使用fastp[6]、FLASH[7]、UPARSE[8]等分析軟件對測序數據進行統計分析，并基于分類學信息，討論傳統自然發酵醬油細菌群落結構。

2 結果分析

2.1 PCR擴增結果

以傳統自然發酵醬油中提取的基因組DNA作為模板，用通用引物對其16S rDNA V3-V4區進行擴增，擴增后的目的片段見圖2。

圖2 PCR擴增產物電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of PCR amplified products注：M為DNA分子質量標準；1為發酵6個月；2為發酵1年；3為發酵2年；4為發酵3年；5為發酵4年。

由圖2擴增產物的電泳圖可知，條帶清晰，可以滿足后續測序實驗要求。

2.2 測序數據分析

傳統自然發酵醬油中擴增DNA樣本，經Illumina MiSeq高通量測序、質控并優化后共得到212762 條有效序列，且每組的有效序列數均在37000以上，占比80%以上，表明本次測序達到傳統自然發酵醬油中后續微生物多樣性分析的要求。

2.3 α多樣性分析

根據傳統自然發酵醬油中97%相似性水平下的OTU信息，對傳統自然發酵醬油中的微生物物種豐富度和多樣性進行分析，結果見表1，在本次傳統自然發酵醬油中樣本測序覆蓋率均在99%以上。

表1 不同發酵時長醬油醅料中α多樣性指數Table 1 α diversity indexes in the soy sauce mash fermented for different time

Shannon-Wiener曲線見圖3，在本次傳統自然發酵醬油的所有樣本中，曲線逐漸穩定。

圖3 Shannon-Wiener曲線分析Fig.3 The analysis of Shannon-Wiener curve

2.4 群落多樣性分析

對傳統自然發酵醬油在不同發酵時長下不同樣品獲得的OTU屬水平上進行物種注釋，統計分析結果見表2，其中屬水平上相對豐度大于1%的菌群柱狀分布見圖4。

表2 不同發酵時間樣品菌群在屬水平上的分布Table 2 The distribution of bacterial community in samples at the genus level with different fermentation time

圖4 不同發酵時長樣品細菌的分布Fig.4 The distribution of bacteria in samples with different fermentation time

由表2可知，在發酵6個月的醬醅中發現27個菌屬，其中豐度較大的菌群為芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、魏斯氏菌屬(Weissella)、大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella)、色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)、片球菌屬(Pediococcus)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)，在發酵1年的醬醅中發現22個菌屬，主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)，在發酵2年的醬醅中發現26個菌屬，主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、魏斯氏菌屬(Weissella)、色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)，在發酵3年醬醅中發現8個菌屬，在發酵4年的醬醅中發現3個菌屬的，其主要菌屬都為芽孢桿菌屬(Bacillus)，這與之前傳統自然發酵豆制品的研究結果相似[9-11]。表明在傳統自然發酵醬油過程中，醬醅中細菌菌群處于動態變化中，且早期出現大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella)表明傳統自然發酵衛生條件不佳[12]，隨著發酵時間延長，醬醅中細菌群落多樣性呈現下降趨勢，群落結構趨于穩定，形成以芽孢桿菌為絕對優勢菌屬并均趨于穩定。其中芽孢桿菌屬(Bacillus)在醬油發酵過程中可以協助真菌分解原料中蛋白質和淀粉，是醬油中醬香風味成分形成的基礎和關鍵[13]；腸球菌屬(Enterococcus)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)等乳酸菌屬是一類存在于醬油、魚醬、豆制品等多種發酵食品及糖漿中的耐鹽或耐高滲壓的乳酸菌，它們在食品發酵過程中可提高食品中有機酸、醛類和酯類等風味物質含量，在提升產品風味、維持產品色澤、拮抗有害雜菌、促進有益酵母生長和提高產品功能性等方面具有重要作用[14]。

對傳統自然發酵醬油不同發酵時長的醬醅中各微生物豐度的相似性進行聚類，傳統自然發酵醬油中微生物總豐度熱圖見圖5。

圖5 各樣本細菌聚類分析熱圖Fig.5 The heat map of the cluster analysis of bacteria in each sample

結合聚類分析結果可知，5個樣本聚成3類，其中Y1和Y2這2個樣本聚為一簇，Y3和Y4樣本聚為一簇，表明兩兩之間樣本相似，傳統自然發酵醬油在發酵過程中細菌結構可以分為3個階段，并于第3年傳統自然發酵醬油進入穩定期。綜上，發酵初期醬油細菌群落結構變化都較大，發酵中期(1～2年)趨于較穩定，發酵后期(3～4年)形成以芽孢桿菌為絕對優勢菌屬并均趨于穩定的細菌菌落結構。

實驗采用Canoco for Windows 5.0對傳統自然發酵醬油過程中細菌菌群，傳統自然發酵醬油在發酵過程中各優勢菌隨著發酵時間的動態變化與分布見圖6。

圖6 傳統自然發酵醬油發酵過程中細菌菌群PCA分析Fig.6 PCA analysis of bacterial community during the fermentation process of traditional natural fermented soy sauce

由圖6可知，橫、縱坐標的PC1和 PC2的貢獻率分別為76.32%和14.98%，并且在傳統自然發酵醬油中，第1年和第2年結構相似，第3年和第4年菌群結構相似，呈現出分為3個階段的細菌群落結構變化規律。

3 結論

本研究對傳統自然發酵醬油中不同發酵時長的細菌群落結構及多樣性進行分析，共發現包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)等在內的41個屬。聚類分析結果顯示，在傳統自然發酵醬油過程中，醬醅中細菌菌群處于動態變化中，且早期出現大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella)表明傳統自然發酵衛生條件不佳，隨著發酵時間延長，醬醅中細菌群落多樣性呈現下降趨勢，形成以芽孢桿菌為絕對優勢菌屬并趨于穩定；傳統自然發酵醬油發酵過程中，細菌群落結構的動態變化呈現出3個發酵階段，并于第3年進入以芽孢桿菌為絕對優勢菌的發酵后期，同時形成趨于穩定的細菌菌落結構。本研究對傳統自然發酵醬油中的細菌群落結構進行了高通量測序分析，后續將對傳統自然發酵醬油中真菌群落結構進行解構，進一步揭示傳統自然發酵過程中的微生物菌群隨著發酵時間的動態變化規律，為揭示傳統自然發酵醬油獨特的產品品質形成、潛力菌株篩選和傳統自然發酵釀造技藝優化提供了理論依據。