響應面法優化ε-聚賴氨酸產生菌的發酵培養基

馬鑫，張子桐，孟鑫巖，王野男，尤麗新*

(1.吉林農業大學 食品科學與工程學院，長春 130118；2.長春科技學院 生命科學學院，長春 130600)

微生物源天然防腐劑有著來源廣泛、價格偏低等優勢[1],天然防腐劑除了微生物源，還有植物源[2-3]，常見的有如下幾種：乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε-聚賴氨酸[4]。其中ε-聚賴氨酸的最適pH值相較于其他兩種防腐劑更為寬泛，且ε-聚賴氨酸的抑菌譜均比其他兩種抑菌譜廣[5]。ε-聚賴氨酸是由多個氨基酸殘基(25～30個)構成的同型單體聚合物，化學法合成的為α型，具有一定的毒性，生物法合成的為ε型，有研究證明后者的抑菌活性比前者更強[6]。

ε-聚賴氨酸是40多年前日本學者Shima S和Sakai H[7]從放線菌發酵液中提取出來的，目前有許多學者對白色鏈霉菌進行誘變，其產量有所提高[8]。另有一些研究者不僅誘變選育了菌株，而且優化其發酵過程，產量均有所提高，但仍然有一定的進步空間[9]。

20世紀80年代，美、日、韓等國已經允許ε-聚賴氨酸在食品中用作防腐劑。2014年，其作為食品防腐劑也正式進入我國市場[10]。ε-聚賴氨酸目前在食品領域用作防腐劑，涵蓋許多食品行業。比如用在延緩水產品品質劣變[11]、蔬菜保鮮[12]、延長肉及肉制品的保質期[13]、食品抑菌膜的制作[14]、某些農產品病害的預防[15]等方面。

為了提高ε-聚賴氨酸產量，同時獲得更大的經濟效益，本試驗優化了突變菌株的培養基主要成分，獲得的相關成果可為工業化生產提供一定的基礎技術支持，以滿足食品市場對此類天然保鮮劑的需求。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料及設備

1.1.1 菌種

本實驗室所保存的經過誘變育種后的白色鏈霉菌。

1.1.2 試驗材料

葡萄糖(分析純)：天津市致遠化學試劑有限公司；糖蜜(分析純)：廣西鑫財投資有限公司；玉米漿(分析純)：南京茂捷微生物科技有限公司；氯化銨(分析純)：天津市光復科技發展有限公司；ε-聚賴氨酸(化學純)：鄭州拜納佛生物工程股份有限公司。

1.1.3 試驗儀器

PB-10型酸度計 德國Sartorius公司；BSD-YX3200型立式雙層智能精密型搖床 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；AK/QC-058型離心機 上海安亭科學儀器廠；UV-1800PC型紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 培養基

液體種子液培養基(M3G培養基)：50 g葡萄糖，5 g酵母膏，10 g (NH4)2SO4，0.8 g磷酸氫二鉀，1.36 g磷酸二氫鉀，0.5 g MgSO4·7H2O，0.03 g FeSO4·7H2O，蒸餾水1 L，0.04 g ZnSO4·7H2O，pH(6.8±0.2)，滅菌條件為121 ℃，20 min[16]。

優化使用發酵培養基：碳源、氮源、無機鹽成分與液體種子培養基相同。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液培養

在平板上選取長勢較好的菌落取1環菌接種于液體發酵培養基中，培養24 h(條件為200 r/min，30 ℃)，以得種子液。

1.3.2 搖瓶發酵培養基的優化

將誘變后的菌株種子液按照10%接種量接入40 mL液體培養基(初始pH值為6.8)中，然后分別培養一定時間(條件為200 r/min，30 ℃)。

1.3.2.1 培養基中碳源、氮源的篩選

a.碳源種類的篩選

土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜使用濃度均為50 g/L[17]，其余營養成分：酵母浸粉5 g/L，無機鹽與優化培養基相同，分別培養3，4，5，6，7 d，取發酵液測ε-聚賴氨酸含量以及菌體干重。

b.有機氮源種類的篩選

酵母粉、魚粉蛋白、小麥蛋白、玉米漿、低溫大豆餅粉、中溫大豆餅粉使用濃度均為15 g/L[18]，其余營養成分：葡萄糖50 g/L，無機鹽與優化培養基相同，分別培養3，4，5，6，7 d，取發酵液測ε-聚賴氨酸含量以及菌體干重。

c.無機氮源種類的篩選

硫酸銨、氯化銨和尿素使用濃度均為15 g/L[19]，其余營養成分：葡萄糖50 g/L，無機鹽與優化培養基相同，分別培養3，4，5，6，7 d，取發酵液測ε-聚賴氨酸含量以及菌體干重。

1.3.2.2 培養基中碳源、氮源配比的篩選

根據碳源、有機氮源、無機氮源選擇結果以及此菌株的生長曲線特性，以ε-聚賴氨酸增加量以及菌體干重增加量為指標，對碳源、氮源分別進行復配試驗。

1.3.2.3 培養基中復合碳源、氮源篩選單因素試驗

選擇復合碳源含量分別為10～50 g/L之間的5個梯度，兩種不同的碳源(比例為3∶2)，其余營養成分為玉米漿5 g/L，氯化銨10 g/L，無機鹽與優化培養基相同，在上述相同條件下培養5 d，分別取發酵液測ε-聚賴氨酸增加量、菌體干重增加量以及pH的變化。

選擇不同的碳源，配比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，碳源總量為30 g/L，其余營養成分為玉米漿5 g/L，氯化銨10 g/L，無機鹽與優化培養基相同，在上述相同條件下培養5 d，分別取發酵液測ε-聚賴氨酸增加量、菌體干重增加量以及pH的變化。

選擇總氮源含量分別為10～30 g/L之間的5個梯度，兩種不同的有機氮源比例為1∶2，其余營養成分為葡萄糖50 g/L，無機鹽與優化培養基相同，在上述相同條件下培養5 d，分別取發酵液測ε-聚賴氨酸增加量、菌體干重增加量以及pH的變化。

選擇兩種不同的氮源，配比分別為0.5∶2.5、1∶2、1.5∶1.5、2∶1、2.5∶0.5，氮源總量為15 g/L，其余營養成分為葡萄糖50 g/L，無機鹽與優化培養基相同，在上述相同條件下培養5 d，分別取發酵液測ε-聚賴氨酸增加量、菌體干重增加量以及pH的變化。

1.3.2.4 培養基優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以ε-聚賴氨酸含量為指標對復合碳源總量、碳源配比、復合氮源總量以及有機氮源和無機氮源配比進行響應面試驗，優化培養基配方，響應面試驗因素水平表見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.3.3 ε-聚賴氨酸含量的測定

參照Itzhaki[20]和Shima的方法。

2 結果與分析

2.1 碳源、氮源種類篩選結果

2.1.1 碳源種類篩選結果

選擇5種常用物質作為碳源，分別為土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜，濃度均為5%，即50 g/L，產量結果見圖1，菌體干重變化見圖2。

圖1 不同種類碳源對ε-聚賴氨酸濃度的影響Fig.1 The effect of different types of carbon sources on the concentration of ε-polylysine

圖2 不同種類碳源對菌體干重的影響Fig.2 The effect of different types of carbon sources on the dry weight of bacteria

由圖1可知，ε-聚賴氨酸濃度總體呈增長趨勢，土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜5種碳源中以甘油和糖蜜為碳源的兩個試驗組ε-聚賴氨酸產量較高，分別為9.008，9.003 g/L。由圖2可知，菌體干重也隨著天數的增加呈上升趨勢，發酵5～7 d增加不明顯；發酵至第3天時，土豆淀粉作為碳源的試驗組菌體干重較高，但其在后續發酵中并沒有大幅度變化，可能是由于土豆淀粉不易溶于水，在測量中產生的誤差。發酵至第5天時，當甘油作為碳源時，其試驗組的菌體干重較高，為20.075 g/L，其次是糖蜜為碳源的兩個試驗組。由于葡萄糖有利于菌體早期的生長，因此碳源最終選擇葡萄糖、甘油和糖蜜進行后續試驗。

2.1.2 有機氮源種類篩選結果

本試驗選擇的有機氮源分別為酵母粉、魚粉蛋白、小麥蛋白、玉米漿、低溫大豆餅粉以及中溫大豆餅粉，濃度均為1%，即10 g/L，配制發酵培養基；接種活化好的種子液后，分別發酵3～7 d，然后測定目標產物含量，結果見圖3，菌體干重變化見圖4。

圖3 不同種類有機氮源對ε-聚賴氨酸濃度的影響Fig.3 The effect of different types of organic nitrogen sources on the concentration of ε-polylysine

圖4 不同種類有機氮源對菌體干重的影響Fig.4 The effect of different types of organic nitrogen sources on the dry weight of bacteria

由圖3可知，ε-聚賴氨酸的產量總體是上升的，玉米漿、低溫大豆餅粉、中溫大豆餅粉作為氮源的3個試驗組ε-聚賴氨酸產量均較高，分別為8.097，8.039，9.002 g/L。但是，低溫大豆餅粉作為氮源的試驗組在發酵4 d后，產量并沒有明顯增加。由圖4可知，除小麥蛋白試驗組外，其他氮源試驗組的菌體干重先增加后減少，其中以酵母菌作為氮源時，該試驗組的菌體干重減少的最明顯，中溫大豆餅粉試驗組減少的最不明顯。小麥蛋白作為氮源時，該試驗組的菌體干重一直處于上升的趨勢，可能是小麥蛋白不利于微生物的前期生長。發酵至第5天時，小麥蛋白作為氮源其菌體干重較高，為16.763 g/L，其次是中溫大豆餅粉、低溫大豆餅粉、玉米漿、魚粉蛋白(后三者相差不多)為氮源的4個試驗組。這幾種氮源在發酵5～7 d產物產量及菌體干重均并無大的變化；由于低溫大豆餅粉試驗組發酵4 d后ε-聚賴氨酸產量沒有明顯增加，小麥蛋白、魚粉蛋白作為氮源的兩個試驗組ε-聚賴氨酸產量不高，因此選擇玉米漿和中溫大豆餅粉作為氮源進行后續試驗。

2.1.3 無機氮源種類篩選結果

由圖5可知，ε-聚賴氨酸的產量隨著發酵天數的增加先增加而后出現了微弱的下降趨勢，其中在發酵第5天時，氯化銨作為氮源的試驗組其目標產物含量較高，為7.628 g/L。但是，硫酸銨作為氮源的試驗組發酵4～7 d，目標產物并沒有明顯增加。由圖6可知，菌體干重先增加而后出現了下降的趨勢，其中硫酸銨作為無機氮源的試驗組在發酵第5天其發酵液的菌體干重較其他兩種無機氮源均高，為10.963 g/L。因此，選擇硫酸銨和氯化銨作為無機氮源進行復配試驗。

圖5 不同種類無機氮源對ε-聚賴氨酸濃度的影響Fig.5 The effect of different types of inorganic nitrogen sources on the concentration of ε-polylysine

圖6 不同種類無機氮源對菌體干重的影響Fig.6 The effect of different types of inorganic nitrogen sources on the dry weight of bacteria

2.2 培養基中復合碳源、復合氮源的篩選結果

根據上述營養物質種類的篩選，分別選出兩種較為合適的營養物質，結合白色鏈霉菌的生長特性，對碳源、氮源進行復配，復配比例根據白色鏈霉菌典型的生長曲線設計。

2.2.1 碳源配比篩選結果

選擇不同的碳源種類進行不同比例復配，以考察其對產物產量及菌體量的影響，結果見圖7。

由圖7可知，2號(葡萄糖∶糖蜜為3∶2)、3號(甘油∶糖蜜為2.5∶2.5)、4號(葡萄糖∶甘油∶糖蜜為3∶1∶1)3個復合碳源試驗組的菌體增加量、ε-聚賴氨酸增加量均高于1號(葡萄糖∶甘油為3∶2)試驗組，且2號、3號、4號3個試驗組在菌體增加量、ε-聚賴氨酸增加量方面非常接近，所以從經濟方面考慮，碳源選擇葡萄糖和糖蜜進行復配，復配比例選擇葡萄糖∶糖蜜為3∶2。

圖7 碳源復配比例篩選結果圖Fig.7 The screening results of compound ratios of carbon sources

2.2.2 氮源配比篩選結果

選擇不同的氮源種類進行不同比例復配，以考察其對產物產量及菌體量的影響，結果見圖8。

圖8 氮源復配比例篩選結果圖Fig.8 The screening results of compound ratios of nitrogen sources

由圖8可知，2號復合氮源組(氯化銨∶玉米漿為2∶1)的菌體增加量以及ε-PL增加量較其他6組明顯突出；1號(氯化銨∶大豆餅粉為2∶1)、3號(氯化銨∶大豆餅粉∶玉米漿為2∶0.5∶0.5)、7號(氯化銨∶硫酸銨∶大豆餅粉∶玉米漿為1∶1∶0.5∶0.5)3個復合氮源試驗組的ε-PL增加量雖然也較高，但是1號、3號、7號這3組的菌體增加量并不明顯。4號(硫酸銨∶大豆餅粉為2∶1)作為復合氮源時，菌體增加量以及ε-PL增加量均不明顯；5號(硫酸銨∶玉米漿為2∶1)作為復合氮源時，菌體增加量以及ε-PL增加量亦均不明顯；6號(硫酸銨∶大豆餅粉∶玉米漿為2∶0.5∶0.5)復合氮源組菌體增加量較為明顯，但是其ε-PL增加量并不明顯。根據上述分析發現，當大豆餅粉與其他氮源種類進行復配時，效果并不理想，可能是因為大豆餅粉會有一部分不能溶于水，從而導致其不能夠完全利用，因此，氮源選擇氯化銨和玉米漿進行復配，復配比例選擇氯化銨∶玉米漿為2∶1。

2.3 復合碳源、復合氮源篩選試驗結果

根據復合碳源、復合氮源的篩選結果，先對響應面試驗中A、B、C、D 4個因素進行單因素試驗，為響應面試驗提供一個合理的數據范圍后，再進行響應面試驗得出最優組合。

2.3.1 復合碳源、復合氮源濃度單因素試驗結果

2.3.1.1 復合碳源濃度單因素試驗結果

將葡萄糖及糖蜜按照固定比例復配，考察其復配后不同的復合碳源總濃度對產物產量及菌體量的影響，結果見圖9。

圖9 復合碳源濃度單因素試驗結果圖Fig.9 Single-factor test results of compound carbon source concentration

由圖9可知，菌體增加量一直呈上升趨勢，但是ε-PL增加量則是先增加后減少，當復合碳源濃度達到30 g/L時，ε-PL增加量達到一個最高點(7.465±0.661)g/L，隨后開始下降，在復合碳源濃度達到40 g/L以后下降趨勢并不明顯，pH值隨著濃度的變化并無特別明顯的變化，保持在4.0左右，因此可以看出濃度的變化對發酵液pH值的影響并不大。綜上，單因素試驗碳源濃度結果為30 g/L。

2.3.1.2 碳源配比單因素試驗結果

將葡萄糖及糖蜜進行不同比例復配，保持一定的濃度，考察其復配后不同的配比對產物產量及菌體量的影響，結果見圖10。

圖10 碳源配比單因素試驗結果圖Fig.10 Single-factor test results of carbon source ratios

由圖10可知，隨著糖蜜量的增加、葡萄糖量的減少，菌體增加量先呈上升趨勢再呈下降趨勢，在碳源配比為1∶4時出現一個最高點，為(7.700±0.361)g/L；ε-PL增加量先出現了一個下降趨勢隨后開始增加，當碳源配比達到1∶4時，ε-PL增加量達到最高點，為(7.982±0.273)g/L，而后開始出現緩慢的下降趨勢。pH值隨著葡萄糖和糖蜜配比的變化，其變化不太明顯，仍然保持在4.0左右。綜上所述，碳源配比結果為葡萄糖∶糖蜜為1∶4。

2.3.1.3 復合氮源濃度單因素試驗結果

將氯化銨及玉米漿按照固定比例復配，考察其復配后不同的復合氮源總濃度對產物產量及菌體量的影響，結果見圖11。

圖11 復合氮源濃度單因素試驗結果圖Fig.11 Single-factor test results of compound nitrogen source concentration

由圖11可知，菌體增加量隨著復合氮源濃度的增加一直呈上升趨勢，但是ε-PL增加量則是先增加后減少，當濃度達到20 g/L時，ε-PL增加量最多，為(6.999±0.503)g/L。pH值有些許變化，呈上升趨勢，即復合氮源濃度越高，pH值也隨之增加。綜上，復合氮源濃度單因素試驗結果為20 g/L。

2.3.1.4 氮源配比單因素試驗結果

將氯化銨及玉米漿進行不同比例復配，保持一定的濃度，考察其復配后不同的配比對產物產量及菌體量的影響，結果見圖12。

圖12 氮源配比單因素試驗結果圖Fig.12 Single-factor test results of nitrogen source ratios

由圖12可知，隨著玉米漿量的增加、氯化銨量的減少，菌體增加量先呈上升趨勢再呈下降趨勢，在氮源配比為1∶2時出現一個最高點，為(7.5±0.254)g/L；ε-PL增加量先是增加，亦是在氮源配比為1∶2時出現一個最高點，為(7.344±0.342)g/L。pH值隨著玉米漿和氯化銨配比的變化，其變化先是保持在5.0左右，在氮源配比為1.5∶1.5時，pH值雖然開始下降，但仍然維持在4.0左右。結合經濟、時間等各方面原因，氮源配比單因素試驗結果為氯化銨∶玉米漿為1∶2。

2.3.2 復合碳源、復合氮源篩選響應面試驗結果

結合單因素試驗結果，以ε-PL含量為指標，以復合碳源濃度、碳源配比、復合氮源濃度以及氮源配比為因素，設計響應面試驗見表1，響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface test results

上述試驗數據擬合的各因素的回歸方程為：Y=14.29+0.19A+0.15B-0.2C-0.053D+0.26AB-0.47AC+0.015AD-0.11BC+0.052BD-0.075CD-0.43A2-0.14B2-0.23C2-0.31D2。并對數據進行方差分析，結果見表3。

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis table

續 表

由表3可知，模型的P<0.05，即此模型差異性顯著，失擬項的P>0.05，即失擬項差異不顯著，說明此模型擬合較好，能夠反映出各因素與結果的關系，即模型可用。根據表3中F值的大小即可判斷影響ε-PL含量的主次順序為C(氮源濃度)>A(碳源濃度)>B(碳源配比)>D(氮源配比)。此試驗中差異極顯著的有交互項AC、二次項A2，達到顯著的有一次項A、C和二次項D2。

2.3.3 響應面曲面圖分析

A、B、C、D兩兩交互作用見圖13～圖18。通過對6個曲面的觀察可以看出響應面與各因素之間的作用。

圖13 碳源濃度與碳源配比對ε-PL含量的影響Fig.13 The effect of carbon source concentration and carbon >source ratios on ε-PL concentration

由圖13可知，假設碳源配比保持不變，ε-聚賴氨酸含量變化隨著碳源濃度的增加先上升后下降，說明碳源濃度過高對ε-聚賴氨酸含量不僅沒有正方向作用反而還有反作用。當碳源濃度固定時，響應面陡峭程度較為平緩，隨著碳源配比的變化其變化不大，即響應值(ε-聚賴氨酸含量)變化不大。說明A碳源濃度、B碳源配比兩因素之間的交互作用不顯著。

由圖14可知，當氮源濃度固定不變時，ε-聚賴氨酸含量隨著碳源濃度的增加，其變化先呈上升趨勢后出現一小部分下降趨勢。當碳源濃度固定不變時，ε-聚賴氨酸含量隨著氮源濃度的增加，其變化先呈上升趨勢后出現一部分平緩趨勢，說明氮源濃度過高并沒有積極作用。說明A碳源濃度、C氮源濃度的交互作用顯著。

圖14 碳源濃度與氮源濃度對ε-PL含量的影響Fig.14 The effect of carbon source concentration and nitrogen source concentration on ε-PL concentration

由圖15可知，氮源配比固定不變，ε-聚賴氨酸含量隨著碳源濃度的增加其變化先上升后下降。當碳源濃度不變時，響應面陡峭程度較為平緩，隨著氮源配比的變化其變化不大，即響應值(ε-聚賴氨酸含量)的變化不大。說明A碳源濃度、D氮源配比的交互作用不顯著。

圖15 碳源濃度與氮源配比對ε-PL含量的影響Fig.15 The effect of carbon source concentration and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

由圖16可知，假設C固定不變，響應值隨著碳源配比的變化其變化趨勢平緩。當B不變時，隨著氮源濃度不斷增加，響應面陡峭程度較為平緩，響應值變化不大。說明B碳源配比、C氮源濃度的交互作用不顯著。

圖16 碳源配比與氮源濃度對ε-PL含量的影響Fig.16 The effect of carbon source ratios and nitrogen source concentration on ε-PL concentration

由圖17可知，假設氮源配比固定不變，響應面變化隨著碳源配比的增加其趨勢平緩。當B不變時，隨著D數值的變化，響應面陡峭程度較為平緩，響應值變化不大。說明B碳源配比、D氮源配比的交互作用不顯著。

圖17 碳源配比與氮源配比對ε-PL含量的影響Fig.17 The effect of carbon source ratios and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

由圖18可知，假設氮源配比不變，ε-聚賴氨酸含量隨著C的增加，其變化先呈上升趨勢后出現一小部分下降趨勢。當C固定時，隨著氮源配比的變化，響應面陡峭程度較為平緩。說明C氮源濃度、D氮源配比的交互作用不顯著。

圖18 氮源濃度與氮源配比對ε-PL含量的影響Fig.18 The effect of nitrogen source concentration and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

2.3.4 驗證性試驗

此軟件得出最佳結果為：碳源配比為葡萄糖∶糖蜜為1∶4，復合碳源濃度為40 g/L，復合氮源濃度為15 g/L，氮源配比為氯化銨∶玉米漿為1∶2。經過3次平行試驗，求取平均值，得出在此條件下其發酵液中ε-聚賴氨酸含量為14.76 g/L。

3 結論

碳源種類選擇葡萄糖、甘油、糖蜜，有機氮源種類選擇玉米漿和中溫大豆餅粉，無機氮源種類選擇硫酸銨和氯化銨。碳源配比為葡萄糖∶糖蜜為3∶2，氮源配比為氯化銨∶玉米漿為2∶1。

響應面試驗優化的復合碳源、復合氮源結果為：復合碳源濃度為40 g/L，碳源配比為葡萄糖∶糖蜜為1∶4，復合氮源濃度為15 g/L，氮源配比為氯化銨∶玉米漿為1∶2。

發酵培養基配方為：葡萄糖8 g/L，糖蜜32 g/L，氯化銨5 g/L，玉米漿10 g/L，MgSO4·7H2O 3.2 g/L，FeSO4·7H2O 0.08 g/L，ZnSO4·7H2O 0.04 g/L，K2HPO42.4 g/L，KH2PO43.2 g/L，在此條件下其發酵液中ε-聚賴氨酸含量為14.76 g/L。