一家系遺傳性多發性骨軟骨瘤的致病突變基因鑒定

張硯卓，李閃，吳成愛，陶劍鋒，王倩倩，于淑男，魏禎杰，姜旭

1 北京市創傷骨科研究所分子骨科研究室，北京100035；2 北京積水潭醫院矯形骨科

遺傳性多發性骨軟骨瘤（HME）又稱遺傳性多發性外生骨疣，是一種罕見的常染色體顯性遺傳的骨骼肌肉疾病，發病率約為1/50 000［1］。HME 的外顯率100%，主要特征是長骨干骺端外生多處軟骨骨疣，70%～90%的受累部位發生在股骨遠端、脛骨近端、腓骨和肱骨［2］，常伴有慢性疼痛、關節活動受限、肢體畸形、身材矮小、脊柱側凸和神經血管異常等癥狀。2%的HME 患者骨軟骨瘤會發生惡化，轉變為骨癌或骨肉瘤［3］。HME 具有遺傳異質性，目前已報道3 個致病基因，分別為EXT1（MIM 608177）、EXT2（MIM 608210）和EXT3（MIM 600209）［4］。70%～95%的HME 患者由EXT1或EXT2基因突變導致，這兩同源基因編碼高爾基相關糖基轉移酶，參與硫酸肝素生物合成［5-6］。HME 患者后代患病風險高達50%，具有較高的遺傳性和致畸性，因此有必要進行基因檢測或產前診斷［7］。2018年9月—2021年5月，我們收集一個中國漢族人HME 家系，對該家系中5例患者進行致病突變鑒定，以明確其遺傳學病因，為家系的遺傳咨詢和產前診斷提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 入選對象為2018 年就診于北京積水潭醫院的一個HME家系。先證者（Ⅲ3）出生時未見異常，因膝關節活動受限、疼痛2018 年到我院矯形骨科就診。經X線檢查胸骨、肋骨、肩胛骨、股骨、脛腓骨、手指、腳趾頭等共有20 處軟骨瘤（圖1a～d）。對先證者家系成員進行X線檢查，明確其父親、姐姐和姐姐的兩個孩子均患病。該HME 家系圖見圖2。先證者（Ⅲ3）自述其2歲時發病。他的父親Ⅱ2自述7歲時發病，在股骨、脛腓骨、手指、前臂、腳踝共有6處軟骨瘤（圖1e）。先證者的姐姐Ⅲ2，發病年齡1 歲，腳底板、手指、脛骨共有6 處軟骨瘤（圖1f）。先證者大外甥Ⅳ1，發病年齡7 個月，在肋骨、肩胛骨、前臂、手指、脛骨、腓骨、腳踝共有16 處軟骨瘤（圖1g）。先證者小外甥IV2，發病年齡7 個月，在肋骨、肱骨、股骨、脛腓骨、鎖骨、前臂、手指共有22 處軟骨瘤（圖1h）。患者受累部位主要集中在股骨和脛骨。所有患者因骨疣存在，使時常活動受限，并且患者父親和其倆外甥均有肢體畸形的表型，身高也較正常人偏矮。先證者（Ⅲ3）的母親（Ⅱ7）無任何多發性骨軟骨瘤的臨床表現，血液生化學檢測發現：先證者、先證者之父（Ⅱ3）、姐姐（Ⅲ2）和兩個外甥（Ⅳ1和Ⅳ2）血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平分別為1.05、1.09、1.07、1.07、1.08 mmol/L 低于正常值（1.16～1.42 mmol/L）。在取得家系成員的知情同意后，采集家系中5 名患者和II7 靜脈外周血4～5 mL。EDTA抗凝，置于4 ℃保存。本研究獲得北京積水潭醫院倫理委員會批準，家系成員均簽署知情同意書。

圖1 HME家系X線影像圖

圖2 HME家系圖

1.2 HME家系致病突變基因鑒定

1.2.1 基因組DNA提取 采用QIAamp（Qiagen：貨號51104）血液基因組小量提取試劑盒提取外周血基因組DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 全外顯子組測序 本研究的全外顯子組測序，委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。將基因組DNA經Covaris破碎儀隨機打斷成180～280 bp片段，經末端修復和加A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA 文庫。帶有特異index 的文庫pooling后與生物素標記的探針進行液相雜交，再使用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來，經PCR 擴增后進行文庫質檢，合格即可進行測序。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0 進行初步定量，隨后使用NGS3K/Caliper 對文庫的insert size 進行檢測，insert size 符合預期后，使用qPCR 方法對文庫的有效濃度（3 nmol/L）進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格，運用Illumina HiSeq2500平臺進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 測序得到的數據經過基本數據過濾（Base calling、過濾接頭序列、去污染），運用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件比對至人類基因組參考序列GRCh37/hg19 上，經ANNOVAR軟件對變異位點進行注釋，篩選致病變異。應用千人基因組數據（1000 g_all）、ExAC 數據庫、ESP6500數據庫（esp6500si_all）、gnomAD 數據（gnomAD_ALL和gnomAD_EAS）和dsSNP 等頻率數據庫，過濾掉頻率高于1%的突變。應用預測軟件SIFT（http：//sift.jcvi.org/）、Polyphen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVEAN（http：//provean.jcvi.org/seq_submit.php）、Mutation Taster（http：//www.mutationtaster.org）、M-CAP（http：//bejerano.stanford.edu/mcap/）和CADD（http：//cadd.gs.washington.edu/）對變異位點進行致病性預測。同時使用數據庫ClinVar（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）、OMIM（https：//omim.org）和HGMD（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）確定變異是否被收錄。根據2015年美國醫學遺傳學與基因組學學會（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南對變異致病性進行分級。

1.2.4 PCR-Sanger 測序 從UCSC 人類基因組數據庫獲得EXT1（NM_000127.2）基因序列，使用在線引物設計軟件Primer5.0，針對候選變異設計特異性引 物（EXT1-E6-F：5’-ATACCATGGGAGAGACAGCA-3’和EXT1-E6-R：5’-GTAACGAGGCAGGATGAATG-3’），以家系成員基因組DNA 為模板，擴增變異位點所在的EXT1基因的第六個外顯子。PCR反應體系：正反向引物各0.75 μL（10 pmol/μL），La taq 聚合酶0.25 μL，2×GC buffer I 12.5 μL，無菌去離子水6.25 μL，DNA 模板100 ng；PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行36 個循環；72 ℃延伸8 min。測序產物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司，采用ABI3730xl 測序儀進行測序。測序結果經Codon-Code Aligner序列分析軟件分析。

2 結果

根據全外顯子組測序結果，用Sanger 測序對先證者和家人進行突變驗證。結果表明：先證者EXT1基因第6 外顯子存在雜合突變c.1468dupC，該突變導致EXT1基因編碼的蛋白第490 位亮氨酸轉變為脯氨酸，并在其后的第31 位形成終止密碼子（p.Leu490Profs*31，見圖3）；該突變可引起EXT1基因mRNA 的翻譯提前終止，導致蛋白質功能缺失。家系中其他4例患者（Ⅱ3、Ⅲ2、Ⅳ1和Ⅳ2）均檢測到與先證者相同的突變（c.1468dupC），表型正常的家系成員未檢測到該位點的變異。家系驗證結果表明，家系內存在基因型與表型共分離。多個同源序列比對分析表明，EXT1基因c.1468編碼的第490位亮氨酸在多種不同生物種屬內均是保守的。

圖3 EXT1基因c.1468dupC變異位點Sanger測序結果

3 討論

HME 是一種遺傳異質性的骨骼系統疾病，患病率為1/50 000，主要影響軟骨內骨生長。外生骨疣的數量和大小不一，病變的位置也不同［8-9］。該疾病的特征是形成大量的軟骨帽和良性骨腫瘤（外生骨軟骨或骨軟骨瘤），通常伴有骨骼畸形和身材矮小。在少數患者中，外生軟骨會發生惡性轉化，導致骨肉瘤或軟骨肉瘤［10］。HME 患者膝關節畸形的發生率很高，約有1/3 的患者發展為膝外翻。30%～60%的HME患者中可見前臂弓狀畸形，患者其他骨骼畸形還包括肢體長度不一致、下肢外翻畸形和脊柱側凸。與女性患者相比，男性患者通常表現出更嚴重的癥狀，這可能是由于男性生長板閉合較晚，從而有更多的時間形成外生骨瘤造成的。此外，有較多外生骨的患者通常有較嚴重的殘疾和畸形［10］。該疾病沒有特異性藥物，只能在惡變的情況下手術切除癥狀最明顯、問題最嚴重的骨軟骨瘤［3］。70%～95%的HME 患者是由EXT1和EXT2突變所致，其中EXT1占56%～78%，EXT2占21%～44%［10］。EXT基因家族由腫瘤抑制基因組成，其功能的喪失或失調導致HME。EXT蛋白是定位于內質網的Ⅱ型跨膜蛋白，包括一個N 端細胞質尾部、一個跨膜結構域、一個柄和一個大的球狀結構域［11-13］。EXT1和EXT2在高爾基體中形成異寡聚糖基轉移酶，并與糖基轉移酶活性密切相關，通過交替添加GlcAc 和GlcNAc殘基延長HS鏈，參與硫酸肝素（HS）聚合［14］。EXT1/EXT2復合體比單獨的EXT1或EXT2具有更高的糖基轉移酶活性。由于HME 具有異質性，且EXT1/EXT2基因片段較大，又缺少突變熱點，應用WES 技術于HME患者突變鑒定［15］。

多發性骨軟骨瘤通常在兒童和青少年時期增加骨肉瘤的大小和數量。盡管它們對長骨的近骨骺端區有偏好，但事實上可以出現在身體的任何骨骼上，包括短骨、扁骨和不規則骨［12］。研究［16-18］表明，許多HME 患者在發病早期甚至后期都沒有任何臨床癥狀。在我院矯形骨科接診的患者中，一家系中三代出現患者，且全部自愿接受致病突變基因鑒定的情況并不常見。本研究所收集的家系中，所有患者因外生骨疣使活動受限，但軟骨未惡化成骨肉瘤或軟骨肉瘤，且患者未采用手術治療。家系中成年患者（Ⅱ2、Ⅲ2 和Ⅲ3）身高均低于正常人，且先證者父親（Ⅱ2）和他倆外甥（Ⅳ1 和Ⅳ2）均有四肢畸形。從患者的臨床表型、四肢畸形和骨疣數量，我們觀察到患者嚴重程度在家系中呈現出早現的現象。在患者血液生化檢測中發現，HDL-C 低于正常值。HDL-C 是體內重要的脂蛋白，它的生物學功能主要體現在參與膽固醇的逆向轉運，改善血管內皮功能，減少黏附因子表達，逆轉低密度脂蛋白氧化及抗凋亡等多個方面。研究發現HDL-C 水平與心血管病風險呈負相關，血漿HDL-C 每上升0.026 mmol/L，心血管事件發生風險可下降2%～3%。在血漿HDL-C組成及形成過程中最關鍵蛋白為apoA1和ABCA1［17］。在我們的研究中未發現apoA1 和ABCA1 的異常（含量及基因檢測）。至今，未見HME 與HDL-C 相關性研究報道。HME 導致血漿HDL-C 水平降低還是兩者互不相干而是由其他原因引起的HDL-C 水平降低，這些問題我們將進一步進行探究。

本研究我們通過全外顯子組測序對一個常染色體顯性遺傳的HME家系進行致病突變分析，發現該家系是由EXT1基因第6 外顯子的一個移碼突變c.1468dupC（p.Leu490Profs*31）導致，該突變導致第490位后的編碼氨基酸發生移碼，并在第521位引入終止密碼，使EXT1基因編碼全長為746氨基酸組成的肽鏈縮短至由521 個氨基酸組成的截斷型蛋白。EXT1基因編碼硫酸肝素生物合成所需的糖基轉移酶。EXT1基因上的致病突變引起硫酸乙酰肝素聚合酶合成障礙或降解，調節軟骨細胞增殖成熟的信號被破壞，導致骨骺生長板發育異常，但其中的具體調控機制并不清楚［11-15］。迄今為止，數據庫Human Gene Mutation Database （HGMD，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.html）和Multiple Osteochondromas Mutation Database（MOdb，http：//medgen.ua.ac.be/LOVD）已報道數563 種EXT1和267種EXT2基因突變與HME 相關，隨機分布于各個外顯子區域［6］。大多數已知的致病變異會導致截斷蛋白的產生，如移碼突變、無義突變和剪接位點突變，錯義變異并不常見。檢索HGMD 數據庫發現，本研究在一個中國人HME家系中發現的上述突變，曾在日本人群中被報道，再次證實了該突變的致病性［16］。

總之，我們在中國HME 家系中發現一個EXT1基因的突變，該結果進一步擴展了EXT1基因的突變譜，有利于后續的遺傳咨詢和產前診斷，也為研究HME發病機制提供更多依據。