焦亡與缺血性腦卒中關(guān)系的研究進(jìn)展

魯明 郭帥 劉恒興

[摘要]焦亡是一種炎癥類型的程序性細(xì)胞死亡方式，發(fā)生于炎癥小體激活后。焦亡直接由最近發(fā)現(xiàn)的一個被稱為Gasdermin（GSDM）的成孔蛋白家族調(diào)節(jié)，其最具特征的是Gasdermin D（GSDMD）。最近的研究表明焦亡與多種神經(jīng)系統(tǒng)病變的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，尤其在缺血性腦卒中的病理發(fā)展中，焦亡有廣泛的參與。本文主要討論誘發(fā)焦亡的分子機(jī)制和發(fā)生缺血性腦卒中時焦亡的分子靶點，以期為缺血性腦卒中后腦損傷的治療及預(yù)后提供新的策略。

[關(guān)鍵詞]焦亡;炎癥小體;Gasdermin D;缺血性腦卒中

[中圖分類號] R743.3? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）08-0060-04

Research progress on the relationship between pyroptosis andischemic stroke

LU? MingGUO? ShuaiLIU? Hengxing1

1. Department of Human Anatomy and Histoembryology， Xinxiang Medical University， Henan， Xinxiang 453000， China;2. Laboratory ofHuman Anatomy， Sanquan College ofXinxiang Medical University， Henan， Xinxiang 453000， China?? [Abstract] Pyroptosis is a type of inflammatory programmed cell death that occurs after the activation of inflammasome. Pyroptosis is directly regulated by a recently discovered pore-forming protein family called gasdermin （GSDM）， the most characteristic of which is gasdermin D （GSDMD）. Recent studies have shown that pyroptosis is related to the pathogenesis of a variety of nervous system diseases， especially the ischemic stroke. This paper mainly discusses the molecular mechanism of inducing pyroptosis and the molecular targets of pyroptosis in ischemic stroke， in order to provide a new strategy for the treatment and prognosis of brain injury after ischemic stroke.

[Key words] Pyroptosis; Inflammasome; Gasdermin D; Ischemic stroke

程序性細(xì)胞死亡是一種大腦發(fā)育、維持體內(nèi)激素水平以及清除感染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的重要特征。程序性細(xì)胞死亡存在12種類型，從非炎癥性（如凋亡）至高度促炎性（如焦亡），每種類型由獨特的分子特征定義。程序性細(xì)胞死亡從根本上不同于壞死，壞死是瞬間的、災(zāi)難性的，無法通過藥理學(xué)或基因干預(yù)口。

細(xì)胞凋亡是由微環(huán)境的擾動引起的并由半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）活化，主要是caspase-3 的活化，這類細(xì)胞死亡方式在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中已被深入研究2]。然而非凋亡性炎性細(xì)胞死亡作為神經(jīng)退行性變的重要決定因素越來越受到重視，特別是促炎癥和溶解性細(xì)胞程序性死亡一焦亡，已成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵因素，與很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，如缺血性腦卒中。了解焦亡和這類疾病的關(guān)系，探索缺血性腦卒中的細(xì)胞死亡途徑是開發(fā)有效治療方法的基礎(chǔ)。

1 焦亡的分子機(jī)制

與凋亡不同，焦亡是溶解性、促炎癥的，其特征是形成損害膜完整性的膜孔。焦亡依賴于細(xì)胞死亡的執(zhí)行者-Gasdermin（GSDMD）蛋白質(zhì)，其中 GSDMD蛋白的發(fā)現(xiàn)，將人們對焦亡的認(rèn)識引領(lǐng)到一個新的高度13—51。此外，焦亡是由caspase—1引起的，Caspase—1在形成炎癥小體的細(xì)胞溶質(zhì)多聚體平臺上被激活，這種分子主要通過保守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用獲得[6—71，它們是炎癥小體激活焦亡下游的主要驅(qū)動因素。炎癥小體分為標(biāo)準(zhǔn)的或非標(biāo)準(zhǔn)的，具體取決于caspase—1是否與之結(jié)合，炎癥小體的激活是介導(dǎo)后續(xù)GSDMD蛋白活化和細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵步驟。標(biāo)準(zhǔn)和非標(biāo)準(zhǔn)的炎癥小體都可以直接介導(dǎo)GSDMD裂解18—121，因此可在GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的分裂中充當(dāng)重要的檢查點。

最初使用人和小鼠細(xì)胞確認(rèn)GSDMD為焦亡劊子手是為了回應(yīng)經(jīng)典和非經(jīng)典炎癥小體活化113—15]。多項研究證實了GSDMDN端活化具有成孔的能力，而 GSDMD C 端自身抑制性作用也被提出[16-20]。雖然 GSDMD 在許多細(xì)胞類型中均有表達(dá)，但轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子2（interferon regulatory factor 2， IRF2）可控制 GSDMD 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄上調(diào)在某些細(xì)胞類型中是必需的，以提高蛋白質(zhì)水平，誘導(dǎo)焦亡[21]。但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，IRF2是否是驅(qū)動 GSDMD 表達(dá)的唯一轉(zhuǎn)錄因子，以及它是否是 GSDMD 介導(dǎo)焦亡的重要調(diào)節(jié)因子目前尚不清楚。雖然 GSDMD 家族的其他成員最近已經(jīng)被確定（如 GSDME），但 GSDMD 是焦亡最顯著的特征，仍是本文討論的重點。

2焦亡途徑

從歷史上看，是否依賴 caspase-1家族蛋白酶被認(rèn)為是焦亡的定義特征。發(fā)現(xiàn) GSDMD 后，對焦亡的定義進(jìn)行了修訂，包括依賴 GSDMD 作為必需的分子特征和依賴 caspase-1家族兩種特性，但也發(fā)現(xiàn)其他 caspase 家族成員，包括 caspase-3和 caspase-8也可以處理 GSDMD，導(dǎo)致焦亡。 Caspase-8在活化轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）b-抑制激酶-1（TAK1）的情況下切割并激活 GSDMD，促使對依賴于 caspase-1家族蛋白酶的焦亡的定義進(jìn)行重新評估。在體外，重組 caspase-8可裂解小鼠和人的 GSDMD，盡管效率低于重組 caspase-1[5]。正如對神經(jīng)營養(yǎng)體的幾項研究發(fā)現(xiàn)所強(qiáng)調(diào)的那樣，如絲氨酸蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶 G，也可以在附近切割 GSDMD caspase-1/4裂解位點，釋放具有生物活性的 P30 N 末端區(qū)域。

雖然 caspase-8可以切割并激活 GSDMD 和 GSDME，從而導(dǎo)致焦亡[5]，而 caspase-3只能通過切割 GSDME 來導(dǎo)致焦亡，且 caspase-3-GSDME 途徑介導(dǎo)焦亡的主要途徑見于有關(guān)癌癥文獻(xiàn)報道中[3]， GSDME 也被確定為暴露于凋亡刺激后的二次壞死機(jī)制。這些焦亡途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中活躍的細(xì)胞類型有待確定。

3 GSDMD的結(jié)構(gòu)與功能

人類 GSDMD 含有242個氨基酸（amino acid， AA）N 末端結(jié)構(gòu)域和199個 AA C 末端結(jié)構(gòu)域[22]。 GSDMD 的兩個結(jié)構(gòu)域是構(gòu)成自身抑制機(jī)制的基礎(chǔ)，其中 C 末端結(jié)構(gòu)域組成性地與 N 末端結(jié)構(gòu)域相互作用并抑制 N 末端結(jié)構(gòu)域。在被 caspase-1/4切割后， C 末端的自身抑制作用被去除，釋放形成孔的 P30N 末端片段。N-GSDMD 的實驗性過表達(dá)單是片段就足以激活焦亡[13]，在質(zhì)膜上脂質(zhì)結(jié)合觸發(fā) N-GSDMD 寡聚形成跨膜孔。這些氣孔潛在性破壞了局部滲透壓，導(dǎo)致腫脹、膜破裂和溶解，迅速將細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外環(huán)境。利用原子力和電子顯微鏡，很多課題組已經(jīng)觀測到 GSDMD 裂解后數(shù)分鐘內(nèi) N 端就會形成膜孔[16]。決定 GSDMD 孔的形成因素是否會導(dǎo)致活細(xì)胞釋放細(xì)胞因子或致細(xì)胞焦亡目前仍在調(diào)查中。

4中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞焦亡

在不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞群中，使用各種不同的免疫組化方法對炎癥小體激活和焦亡進(jìn)行了評估。雖然并非所有類型的細(xì)胞都能合成促炎因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18， IL-18）[23]，但事實上所有類型的細(xì)胞暴露于促炎癥刺激物時，均會過度激活炎癥小體，在特定情況下發(fā)生焦亡。本文特別關(guān)注的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞（brain? macrophage-like cells，BMC）發(fā)生炎癥時的焦亡證據(jù)。

BMC 包括常駐的小膠質(zhì)細(xì)胞、血管周圍細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞和腦膜巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞可以被神經(jīng)炎癥高度誘導(dǎo)，在穩(wěn)態(tài)條件下表達(dá)炎癥體成分。Nod 樣受體蛋白（Nod-like receptor pyrin? domain， NLRP）炎癥小體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與神經(jīng)變性疾病關(guān)系密切，其在缺血性腦卒中扮演的炎癥損傷角色也日益引起重視。在基線水平人類胚胎組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞，表達(dá) NLRP1、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like? protein containing CARD， ASC）、黑色素瘤缺乏因子2（absent inmelanoma 2， AIM2）和 caspase-1轉(zhuǎn)錄。而 NLRP3轉(zhuǎn)錄在暴露于啟動刺激時可被誘導(dǎo)，在人類胚胎小膠質(zhì)細(xì)胞中可誘導(dǎo) caspase-1裂解和 IL-1β成熟，以響應(yīng)多種 NLRP3炎癥體激活刺激物。并且在人類小膠質(zhì)細(xì)胞暴露于 NLRP3炎性體激活刺激物后的炎性體激活下游發(fā)現(xiàn) GSDMD 依賴性焦亡。

5缺血性腦卒中的炎癥小體和焦亡

自從2002年發(fā)現(xiàn)炎癥小體以來，這一途徑一直被認(rèn)為與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病機(jī)制有關(guān)。最近研究顯示，當(dāng)發(fā)生缺血性腦卒中時，在缺血半暗帶的腦細(xì)胞焦亡的上游分子高表達(dá)，提示焦亡在腦缺血損傷發(fā)展中的重要作用。細(xì)胞焦亡時釋放大量胞內(nèi)容物和促炎介質(zhì)（如 IL-1β、IL-18等）[23]，誘導(dǎo)級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡的信號途徑、關(guān)鍵分子靶標(biāo)逐漸得到認(rèn)識，正在成為缺血損傷研究的新熱點。2018年P(guān)on等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)缺血性中風(fēng)激活小膠質(zhì)細(xì)胞后， NLRP1、NLRP3、NLRC4和 AIM2炎性小體蛋白分子的表達(dá)增多、活化增強(qiáng)。用免疫印跡分析表明小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血條件下可釋放炎性小體和激活的促炎因子，而后介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和本身的焦亡。

炎癥小體成分（包括炎癥小體相關(guān)細(xì)胞因子、NLRP1、NLRC4、ASC和caspase-1/11）在多種缺血性腦損傷模型中具有保護(hù)作用，但并非所有研究都認(rèn)為炎癥小體抑制具有保護(hù)作用1251。可能在早期（梗死后30min內(nèi)）神經(jīng)元 caspase-1和caspase-3 被激活，如caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk可阻止體內(nèi) caspase—3的激活。血栓栓塞性卒中后，神經(jīng)元和巨噬細(xì)胞和/或小膠質(zhì)細(xì)胞對各種炎癥組分（包括NLRP1、ASC和caspase-1）均呈免疫陽性;缺血性中風(fēng)后也檢測到NLRP2免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞126]。局灶性腦缺血已被證明在缺血半暗帶區(qū)上調(diào)IL—1β和IL—18，下游小膠質(zhì)細(xì)胞TREM—1受體和激酶SYK的表達(dá)增高，且伴隨GSDMD增加表達(dá)和裂解。正如所證明的，小膠質(zhì)細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）導(dǎo)致BMC特別容易發(fā)生細(xì)胞焦亡，通過Iba—1與GSDMD的共定位和透射電子顯微鏡證明在細(xì)胞質(zhì)膜中存在GSDMD孔的分布。

6 小結(jié)

本文強(qiáng)調(diào)了GSDMD作為驅(qū)動因素的焦亡的關(guān)鍵進(jìn)展，促炎癥細(xì)胞程序性死亡—焦亡和缺血性腦卒中的關(guān)系，以及在今后的研究中，必須著力解決的幾個重要問題。如促炎癥反應(yīng)與缺血性腦卒中的細(xì)胞因子產(chǎn)生和焦亡，需要進(jìn)一步研究GSDMD在細(xì)胞因子釋放和代謝中的功能，探索清楚這一具有挑戰(zhàn)性的細(xì)胞死亡方式。此外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的獨特特性，包括長壽命、終末分化、更新能力低等，以及精細(xì)和復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，可能激發(fā)對炎癥刺激的獨特反應(yīng)。目前的研究證據(jù)表明通過阻止細(xì)胞焦亡可減輕缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展，通過靶向干預(yù)細(xì)胞焦亡有望使缺血性腦卒中在治療上取得新的突破，有望在未來成為阻斷缺血性腦卒中進(jìn)展的有效治療方法，但目前的研究多以機(jī)制研究為主，且多在細(xì)胞和動物水平上進(jìn)行，接下來可完善已有的研究成果，進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞焦亡相關(guān)過程與缺血性腦卒中關(guān)系的臨床研究，為缺血性腦卒中的治療提供更有效的策略。

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（收稿日期：2021-11-26）