荔枝玫瑰酒延緩小鼠皮膚衰老的研究

徐 瑩， 李曉娟， 孟 君， 張 凱， 唐 雪*

（1. 江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 株洲千金藥業股份有限公司，湖南 株洲 412000）

皮膚受環境、年齡、生活方式等影響，往往容易引起結構、功能和外觀的變化，例如皺紋的增加、皮膚松弛、干燥粗糙等衰老特征。 皮膚衰老是一個高度復雜且尚未完全了解的過程，自由基衰老學說指出衰老是由各種氧自由基（ROS）在體內過度積累，過剩的活性氧自由基會導致大分子物質氧化損傷并加速其進程，導致細胞功能受損，進而導致機體衰老[1-2]。 因此，降低ROS 生成和增強抗氧化能力可在一定程度上緩解皮膚衰老進程。

荔枝在我國培植歷史悠久，主要分布于我國東南和西南部地區。 《本草綱目》中認為荔枝果肉具有益智、健氣的功效。 成熟荔枝的果皮呈暗紅色至鮮紅色，果肉瑩白剔透、狀若凝脂、清甜濃香、營養豐富，深受廣大消費者喜愛。 荔枝作為一種藥食同源的果品，其果肉營養成分豐富，富含多糖、酚類等活性物質，具有較強的抗氧化、降血脂等作用[3-5]。 玫瑰是集藥食同源和美化環境為一身的木本植物，花瓣富含維生素C、氨基酸等物質，具有降血糖、抗氧抗炎等生物活性[6]。 此外，玫瑰富含萜類物質，不僅能保持皮膚濕潤，還能深層養護肌膚[7]。

隨著人民生活水平的提高，傾向于以綠色健康的飲食方式來延緩衰老，對自然來源的抗皮膚衰老產品的需求也日益迫切。 開發一款改善皮膚健康的果酒，不但具有很大的市場潛力，而且也能提升產品競爭力。 荔枝和玫瑰自古以來美膚養顏的功效就深入人心，且經大量研究表明，荔枝和玫瑰不僅富含多種營養成分，而且含有大量的多酚類、黃酮類化合物，具有一定的健康功效。 目前，荔枝和玫瑰的銷售方式以鮮銷和提煉精油為主，盡管已有一些發酵型荔枝果酒或玫瑰酒類出現在國內市場上，但是這些產品具有營養健康功效單一、口感色澤欠佳的缺點。 為了克服上述問題，綜合荔枝和玫瑰的營養保健價值，作者所在課題組前期以新鮮荔枝、玫瑰花（重瓣玫瑰花）為主要原料，配以果葡糖漿，依據傳統中藥君臣佐使配方，釀制得到了一款香氣純正和諧、口感純凈爽怡的荔枝玫瑰酒。 然而，荔枝玫瑰酒是否保留了荔枝、玫瑰原有的營養物質和活性成分，長期飲用是否對皮膚具有營養健康功效，還需進一步研究。 因此，作者利用D-半乳糖誘導的小鼠衰老模型對荔枝玫瑰酒可能的功效進行探究，以期為產品的進一步開發和品控提供有價值的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料 荔枝玫瑰酒（體積分數12%）：株洲千金藥業股份有限公司產品。

1.1.2 主要試劑 D-半乳糖、 辣根過氧化物酶、多聚甲醛：國藥集團提供；過氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、羥脯胺酸（HYP）試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測試盒：南京建成生物研究所提供；總蛋白質定量（BCA）試劑盒： 碧云天生物技術研究所提供；Oligo（dT）、dNTP、M-MLV 逆轉錄酶、RNase Inhibitor：美國賽默飛生物科技有限公司產品。 Trizol、SYBR Green Master Mix：南京諾維贊生物科技有限公司產品；腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA 試劑盒、白細胞介素（IL-1、IL-6、IL-10）ELISA 試劑盒：江蘇酶免實業有限公司產品；H&E 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒：北京索萊寶科技有限公司產品。 所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

R686VLT 型超低溫冰箱：美國INVETRO 公司產品；5804R 臺式高速冷凍離心機：美國Thermo Scientific 公司產品；手動輪轉切片機：美國徠卡公司產品；倒置相差顯微鏡：日本Olympus 公司產品；7900HT Fast Real-Time PCR 儀：美國ABI 公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物與分組 動物試驗經江南大學動物營養研究所動物保健與使用委員會批準，根據《中國動物福利和實驗指南》，按照規定執行。60 只5 周齡體質量（29.66±1.21） g 的ICR 雄性小鼠飼喂于江南大學實驗動物中心。保持環境相對溫度為（23±2） ℃和相對濕度為（60±5）%條件下，光照/黑暗周期為12 h/12 h（光照時間為08：00—20：00），所有小鼠均自由采食與進水，每周稱量并記錄體質量和飲水量。

參考文獻[8]實驗方法，除正常組外，剩下5 組注射1200 mg/（kg·d）D-半乳糖造模。 同時，荔枝玫瑰酒組分別飼喂10、20、40 mL/kg （以體質量計）荔枝玫瑰酒（根據文獻[9]研究表明60 kg 成人每日果酒推薦飲用量300 mL，上述荔枝玫瑰酒添加量相當于60 kg 成人每天分別攝入75、150、300 mL 產品），VC 對照組飼喂450 mg/kg（以體質量計）維生素C。所有動物自由采食飲水，6 周后進行樣本采集分析。

1.3.2 樣本采集 飼養結束后， 進行小鼠背部脫毛。 眼球采血后，取小鼠頸背部皮膚、肝臟、腎臟、肌肉，稱質量。 血液放置15 min 后，3500 r/min 離心10 min 分離血清，放置于-80 ℃冰箱待測。 皮膚、肝臟、腎臟、肌肉取同一部位0.1 g，加入0.9 mL 生理鹽水后勻漿，4000 r/min 離心10 min 后分離上清液，按照說明書進行BCA 蛋白質定量后放置于-80℃冰箱待測。

1.3.3 氧化應激指標測定 活性氧自由基測定采用化學發光法[10]。T-AOC 能力、MDA 質量摩爾濃度、SOD 活性、CAT 活性、GSH-Px 活性用相應的試劑盒進行測定。

1.3.4 皮膚理化指標測定 皮膚含水率（水分質量分數）測定：參考文獻[8]實驗方法進行。 皮膚羥脯胺酸（HYP）質量分數嚴格按照試劑盒說明書測定。

1.3.5 血漿炎癥因子的測定 血漿中的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 均嚴格按照ELISA 試劑盒說明書測定。

1.3.6 總RNA 提取和實時熒光定量PCR 分析 采用Trizol 法提取皮膚總RNA， 測定RNA 的純度和濃度， 嚴格按照逆轉錄酶試劑盒（MultiScribe Reverse Transcriptase；Applied Biosystems）說明書進行操作，將RNA 逆轉錄成cDNA。 將cDNA、引物和SYBR Green Master Mix 混合均勻，使用實時熒光定量PCR 擴增并檢測熒光強度，擴增程序如下：95 ℃5 min，循環1 次；95 ℃20 s；60 ℃30 s、72 ℃20 s，循環45 次；72 ℃終末延伸2 min。以β-actin 作為參照基因，采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。 引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 Primers used in RT-PCR

1.3.7 組織切片 解剖小鼠后，取小鼠頸背部皮膚約1 cm×1 cm 方格于體積分數4%多聚甲醛固定液中。 24 h 后取出組織，按照體積分數50%～100%乙醇的梯度脫水，每級30 min。 放入正丁醇中進行透明，每級20 min。浸蠟6 h。將干凈的石蠟在60 ℃水浴反復溶解3 次后倒入石蠟包埋機，將組織包埋在組織包埋盒中，冷卻后切片，厚度為5 μm。 70 ℃烤片30 min，取出后脫蠟。

H&E 染色： 切片嚴格按照H&E 染色試劑盒說明書操作。

Masson 染色： 切片嚴格按照Masson 染色試劑盒說明書進行水化、初染、鹽酸分化、復染、脫水、透明等步驟進行操作，樹脂封片后鏡檢。

1.4 數據處理

結果用平均值±標準差（Mean±SD）表示。 采用SPSS 17.0 軟件對數據進行單因素（ANOVA）方差分析。各組間字母不同表示差異顯著（P＜0.05），字母相同表示無顯著差異。 然后進行Tukey 多重比較檢驗。GraphPad Prism 7.01 軟件處理作圖。體外實驗各指標均進行3 次獨立重復測定。

2 結果與討論

2.1 荔枝玫瑰酒對D-半乳糖誘導老化損傷小鼠體質量、飲水量的影響

由表2 可知，小鼠飼喂6 周后，各組終體質量、飲水量均無顯著性差異（P＞0.05），說明飼喂荔枝玫瑰酒對衰老小鼠體質量及飲水量無顯著影響。

表2 荔枝玫瑰酒對小鼠體質量、飲水量的影響Table 2 Effect of lychee rose wine on body weight and water intake of mice

2.2 荔枝玫瑰酒對D-半乳糖誘導老化損傷小鼠皮膚理化指標的影響

健康皮膚的鎖水能力較強，而衰老皮膚的鎖水能力降低，導致皮膚干燥粗糙，缺乏光澤。 皮膚的結締組織主要由膠原蛋白和彈性蛋白組成。 膠原蛋白占皮膚干質量的70%～80%， 并賦予真皮機械和結構完整性。 羥脯氨酸（HYP）僅存在于膠原蛋白中，常用其質量來評價組織膠原蛋白的總量[11]。 如圖1所示，D-半乳糖導致小鼠皮膚含水率（質量分數）、羥脯胺酸和膠原蛋白質量分數 （以皮膚濕質量計）顯著降低（P＜0.05），這可能是D-半乳糖引起皮膚氧化損傷，膠原纖維合成能力下降，膠原蛋白流失，纖維之間空間間隙減少、拉伸異常，導致皮膚萎縮，粗糙度、干燥度增加[11]。 與之相反，飼喂高劑量荔枝玫瑰酒可顯著提高含水率、羥脯胺酸和膠原蛋白質量分數（P＜0.05），表明適宜劑量的荔枝玫瑰酒可適當改善衰老小鼠皮膚性能。

圖1 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚理化指標的影響Fig. 1 Effect of lychee rose wine on physical and chemical indicators of mice skin

2.3 荔枝玫瑰酒對D-半乳糖誘導老化損傷小鼠皮膚組織形態的影響

皮膚H&E 染色可見，D-半乳糖注射使小鼠皮膚組織形態發生改變，真皮層厚度明顯減少，皮膚萎縮（見圖2）；Masson 染色中膠原纖維呈藍色，通過比較分析發現D-半乳糖誘導皮膚真皮層膠原纖維含量、膠原束空間密度顯著降低（見圖3）。 與之相反， 高劑量荔枝玫瑰酒飼喂可增加真皮層厚度、膠原纖維含量及膠原束空間密度， 其效果與VC 相當（見圖2（c）和（d）和圖3（c）和（d）），表明一定劑量的荔枝玫瑰酒具有改善皮膚老化狀態的功效。

圖2 小鼠皮膚切片H&E 染色圖（×200）Fig. 2 Mice skin pad slice with H&E staining（×200）

圖3 小鼠皮膚切片Masson 染色圖（×200）Fig. 3 Mice skin pad slice with Masson staining（×200）

2.4 荔枝玫瑰酒對D-半乳糖誘導老化損傷小鼠皮膚氧化還原穩態和血漿炎癥因子質量濃度的影響

老化過程中皮膚抗氧化活性的降低是一個至關重要的因素，導致皮膚發生氧化應激、累積的過剩ROS 極易攻擊生物大分子，進而造成RNA 斷裂、脂質過氧化等。 機體處于正常狀態下，自由基與抗氧化系統處于微妙平衡中， 在SOD、GSH-Px、CAT等酶類物質以及維生素C 等非酶類抗氧化物質的共同參與下，ROS 處于濃度中等， 但當機體不足以清除過剩ROS 時， 便會引起細胞信號通路異常，促發氧化應激，從而使得脂質過氧化產物（MDA）大量產生，導致皮膚衰老[12-13]。 如表3～4 所示，與正常組相較， 向小鼠連續注射D-半乳糖會引起皮膚ROS和MDA 水平（質量摩爾濃度）顯著提高，抗氧化酶（GSH-Px、SOD、CAT）活性和T-AOC 能力降低（P＜0.05），促發氧化應激。 而飼喂高劑量荔枝玫瑰酒可在一定程度上恢復上述指標（P＜0.05），改善衰老小鼠皮膚氧化還原穩態。

表3 皮膚氧化還原指標Table 3 Redox index in skin

此外，炎癥因子（TNF-α、白細胞介素等）的浸染會生成大量ROS，進一步加劇氧化損傷，通過激活NF-κB，使MMPs 表達增多，降解膠原蛋白，導致膠原蛋白流失，皮膚衰老加劇[14-15]。 大量研究表明，多酚、黃酮類物質不僅具有抗氧化、猝滅自由基的能力，而且可以通過調節細胞信號通路，抑制炎癥因子生成，有研究者指出，綠茶多酚能減少腸道IL-6和IL-8 的釋放，從而對腸道具有一定的保護作用[16]。Wan 等指出荔枝、玫瑰中富含多酚、黃酮類物質并具有較好的抗氧化抗炎能力[17]。由表5 可知，飼喂高劑量荔枝玫瑰酒可在一定程度上抑制炎癥因子（TNF-α、IL-1、IL-6）的分泌，促進抗炎因子（IL-10）的生成（P＜0.05），這可能與其含有豐富的多酚、黃酮類等植物活性成分有關， 能有效地減少炎癥反應，進而延緩皮膚衰老進程。

表5 血漿炎癥因子質量濃度Table 5 Inflammatory factor content in plasma

表4 皮膚抗氧化酶活性Table 4 Antioxidase activity in skin

2.5 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚膠原蛋白代謝相關基因表達水平的影響

TGF-β1 是細胞生長分化的調控者， 主要負責促進膠原蛋白前體基因（COl1a1、COl3a1）的合成[18]。與之相反，MMPs 是一類降解膠原蛋白的內肽酶，其中MMP-1 和MMP-8 主要催化Ⅲ型和Ⅰ型膠原蛋白降解[19]。研究發現，炎癥因子浸染會激活核因子激活的B 細胞的κ-輕鏈增強子（NF-κB），使MMPs 表達增多，加劇分解膠原蛋白，導致膠原蛋白減少。 轉錄因子AP-1 可以調節TGF-β1 和幾種MMPs 的轉錄，AP-1 活化，抑制了TGF-β 的表達，上調了MMPs的表達，使膠原蛋白分泌減少，膠原分解增加[20]。

如圖4～5 所示，與正常組相比，D-半乳糖處理導致小鼠皮膚TGF-β1 mRNA 表達水平顯著下調，NF-κB、AP-1、MMP-1 及MMP-8 mRNA 的表達顯著上調（P＜0.05），這可能是導致衰老小鼠皮膚膠原蛋白含量減少、含水率降低的主要原因之一。 而飼喂高劑量的荔枝玫瑰酒能顯著上調TGF-β1 和COl1a1 mRNA 的表達， 抑制NF-κB、AP-1、MMP-1及MMP-8 mRNA 的表達水平（P＜0.05）。 結果表明，荔枝玫瑰酒改善衰老皮膚狀態可能與提高皮膚膠原纖維合成與抑制膠原纖維分解相關基因的表達水平有關。

圖4 皮膚膠原合成基因mRNA 表達水平Fig. 4 mRNA expression level of collagen synthesis gene in skin

圖5 皮膚膠原分解基因mRNA 表達水平Fig. 5 mRNA expression level of collagen decomposition gene in skin

2.6 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚抗氧化相關基因表達水平的影響

Nrf2/GSK-3β 是細胞內重要的抗氧化信號通路，對膠原蛋白代謝意義重大[21]。 正常條件下，活化的核因子-E2 相關因子2（Nrf2）被Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Keap1）抑制[22]。 當ROS 等應激物增加時，促進Keap1 半胱氨酸殘基氧化，誘導Nrf2 釋放與活化， 介導Nrf2 易位至細胞核與抗氧化反應元件結合， 啟動多種抗氧化酶表達， 如血紅素加氧酶1（HO-1）、NADPH 醌氧化還原酶（NQO1）等[23]。GSK-3β 是一種糖原合成激酶，介導Nrf2 磷酸化，使其被降解，抑制抗氧化信號通路[24]。

與正常組相比，D-半乳糖皮下注射顯著下調了衰老小鼠皮膚Nrf2、HO-1 及NQO1 mRNA 相對表達水平（P＜0.05），上調GSK-3β 相對表達水平（P＜0.05）（見圖6），這表明皮膚抗氧化通路被抑制。 與之相反，飼喂中、高劑量荔枝玫瑰酒可部分恢復上述基因表達水平，且高劑量效果最好，表明荔枝玫瑰酒的抗氧化保護作用可能與調節抗氧化通路關鍵因子的基因表達水平有關。

圖6 皮膚抗氧化相關基因mRNA 表達水平Fig. 6 mRNA expression level of antioxidant related gene in skin

2.7 討論

皮膚作為機體的第一道屏障，發生衰老的概率與其他組織相比較高[24]。自由基衰老學說認為，當皮膚長期受到紫外線照射、不良生活習慣（如吸煙以及高能量膳食模式等）作用下，自由基大量生成，超出機體所能清除速度時，會造成自由基和抗氧化系統失衡。 一方面，過剩的自由基參與細胞內反應，氧化損傷生物膜， 導致皮膚干燥松弛和重要性能喪失，加劇皮膚衰老[25-27]。 另一方面，炎癥因子浸染，通過激活NF-κB，使MMPs mRNA 表達增多，降解膠原纖維等，羥脯氨酸生成減少，膠原蛋白斷裂紊亂，最終使皮膚硬化衰老[24]。

作者通過構造小鼠衰老模型，初步探討了荔枝玫瑰酒對衰老皮膚的干預作用。 結果表明，飼喂高劑量荔枝玫瑰酒6 周可部分恢復D-半乳糖誘導的小鼠皮膚含水率（水分質量分數）、羥脯胺酸、膠原蛋白質量分數（P＜0.05），支撐皮膚真皮層并且抑制其萎縮、 改善膠原纖維含量及膠原束空間密度，降低皮膚ROS、MDA 和炎性因子含量（P＜0.05），顯著提高抗氧化能力。 可見，適宜劑量的荔枝玫瑰酒具有提高衰老小鼠皮膚抗氧化能力、抑制氧化應激和炎癥反應、緩解皮膚衰老的作用。

許多植物活性成分具有調節機體功能、延緩衰老的作用，如多酚、黃酮類物質等。 已有研究表明，姜黃素可增加Nrf2 介導的NQO1 表達水平[25]；有研究者指出荔枝、玫瑰中富含多酚、黃酮類物質并具有較好的抗氧化抗炎能力[26-27]。 作者所在實驗室前期結果顯示，荔枝玫瑰酒較好地保留了荔枝和玫瑰的植物活性成分，其中多酚、黃酮以及單寧等活性成分，分別達到254.32、430.00、123.25 μg/mL，其中多酚含量顯著高于市售的櫻桃酒和桑椹紅酒，與赤霞珠葡萄酒含量相近[28-31]。 同時，體外抗氧化研究顯示，荔枝玫瑰酒對自由基的清除能力顯著高于荔枝酒、玫瑰酒、葡萄酒和藍莓酒。 植物多酚和黃酮類物質一方面具有良好的抗氧化功能，能夠直接清除機體內自由基，另一方面可通過與細胞炎癥信號分子結合，激活抗氧化信號蛋白通路，減少炎性因子的浸染及氧化反應導致的皮膚老化[32]。 Sarin 等指出在肝損傷小鼠的肝臟細胞中，荔枝中的酚類物質可增加其抗氧化酶活性，減少線粒體ROS 生成，發揮抗氧化功效[31]。 薛麗香等指出，綠茶中EGCG 能降低UVB 誘發的皮膚炎癥， 減少皮膚氧自由基產生，具有保護皮膚的作用[30]。高愛莉等報道，在無毛鼠的光老化實驗中，茶多酚可上調Nrf2 蛋白通路，增加抗氧化酶表達，起到一定的保護皮膚正常生理功能的功效[29]。 因此，綜合上述研究結果推測，荔枝玫瑰酒延緩小鼠皮膚衰老的功效與其含有豐富的植物活性成分密切相關。

3 結語

作者研究了一款荔枝玫瑰酒延緩小鼠皮膚衰老的作用。 結果顯示飼喂高劑量荔枝玫瑰酒可部分改善衰老小鼠皮膚理化性能，增加真皮層厚度和膠原纖維含量，強化衰老小鼠皮膚抗氧化能力；同時通過上調抗氧化基因Nrf2、HO-1、NQO1 和皮膚膠原蛋白合成基因TGF-β1 mRNA 表達水平及恢復分解相關基因MMP-1 及MMP-8 mRNA 表達水平，增強膠原蛋白合成能力。 荔枝玫瑰酒延緩皮膚衰老的功效可能與其含有豐富的植物活性成分密切相關。