溫度與時間對玉米肽美拉德產物風味特性的影響

于靜洋， 周 燁， 張曉鳴， 夏書芹

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

隨著食品工業的快速發展和消費者需求的日益提升，如何使食品安全、美味與健康并存已成為食品科學關注的焦點之一。 因此，食品風味特性的增強與改善對現代食品與餐飲業的發展具有重要意義。 基于美拉德反應開發不同風味的調味品核心基料是改善食品風味品質的有效措施。 借助該反應不僅可以通過加熱形成各類揮發性風味化合物增強食品的香氣，而且也會產生非揮發性的呈味物質如美拉德肽等顯著增強食品的鮮味、醇厚味和持續性[1]。 然而，美拉德反應錯綜復雜，所形成的風味也迥然不同，因此，實現調味品核心基料風味的定向調控對促進食品工業的發展具有指導價值。

相比于氨基酸-還原糖模型體系， 引入肽所構建的美拉德反應體系在多種風味的形成方面更具優勢。 考慮到安全性和經濟成本的問題，人們逐漸由以動物蛋白肽作為反應原料轉向價格低廉、質量穩定的植物蛋白肽[1-2]。 木糖由于其反應活性高且價格低的優勢，常作為碳源進行美拉德反應，賦予多肽良好的風味特性；半胱氨酸的添加則有助于提升大豆肽-木糖體系產物的肉香味[3]。 除了體系的基質外， 溫度和時間是影響美拉德反應過程的直接因素，其變化會促使反應沿不同途徑進行，通過影響中間體的形成速率和積累量，使得產物的風味和滋味產生差異[4-5]。 通常反應速度會隨反應溫度升高而加快，溫度每升高10 ℃，反應速度增加3～5 倍。 但過高的反應溫度可能會形成一些潛在的危害因子，因此通常控制在180 ℃以下，以100～150 ℃較為適宜。 目前，部分學者以植物蛋白酶解物為原料，在美拉德反應強化多肽風味方面進行了系列研究。He 等以菜籽肽為原料，與木糖在80～140 ℃、pH 7.4 條件下加熱2 h， 制得了不同風味特性的菜籽肽風味增強劑[6]。 玉米蛋白質因其水溶性差、氣味特殊限制了其在食品工業中的應用，作者所在課題組前期研究發現玉米肽的美拉德反應產物醇厚味比較突出[7-9]。但迄今為止，以玉米蛋白質為原料，通過美拉德反應調控兼具肉香味和醇厚味的美拉德反應產物的研究還未見報道。

作者基于玉米肽-木糖-半胱氨酸體系，重點考察了反應溫度和時間對其美拉德反應產物風味特性的調控作用；以相對分子質量分布、游離氨基酸組成以及揮發性化合物為指標，考察了反應條件對美拉德反應產物化學組成的影響。 在此基礎上，基于偏最小二乘回歸對美拉德反應產物風味成分和感官特性之間的相關性進行分析，明確影響各感官指標的相關貢獻成分，為不同風味特性玉米肽美拉德反應產物的定向制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白質、復合蛋白酶：安徽強旺調味食品有限公司產品；木糖、半胱氨酸（均為食品級）：上海源葉生物科技有限公司產品；三氯乙酸、乙腈、甲醇等（均為色譜級）：國藥集團化學試劑有限公司產品；C6～C24 的正構烷烴標準品：Sigma 試劑公司產品。

1.2 儀器與設備

DF-101SZ 型集熱式磁力加熱攪拌器：科瑞儀器有限公司產品；5810R 型冷凍離心機：德國Eppendorf 公司產品；KDN-103F 型自動定氮儀：上海纖檢儀器有限公司產品；TSQ 氣質聯用儀：美國賽默飛世爾科技公司產品；Waters 1525EF 高效液相色譜儀：美國沃特世公司產品；安捷倫1100 氨基酸自動分析儀：美國安捷倫公司產品。

1.3 研究方法

1.3.1 美拉德反應產物的制備 稱取適量玉米蛋白粉，加去離子水配成質量分數為10%的分散懸浮液。 于58 ℃、pH 8 條件下采用3000 U/g 的復合蛋白酶酶解3 h，滅酶10 min 后迅速冷卻。4000 r/min冷卻離心20 min，取上清液得到玉米肽[9]。 按照一定比例稱取玉米肽、木糖和半胱氨酸，混合均勻后調節pH 至7.4， 在不同溫度下反應120 min， 或者在120 ℃下反應不同時間，迅速冷卻終止反應，得到玉米肽-木糖-半胱氨酸美拉德反應產物[10]。

1.3.2 美拉德反應產物的感官評定 按照美拉德反應產物質量分數0.1%和食鹽質量分數0.5%的比例配制待測溶液，等量食鹽水為空白對照，所有樣品于60 ℃水浴中保溫。 邀請15 位經驗豐富的感官評定員，對樣品的醇厚味、肉香味、焦香味、持續性、整體可接受性和異味6 項指標進行打分（0～7 分），分值越高效果越強。 重復3 次取平均值計算最終得分[11]。

1.3.3 相對分子質量分布的測定 稱取100 mg 樣品于10 mL 容量瓶中，流動相定容，于10000 r/min離心15 min，微孔過濾后進樣[12]。 采用GPC 軟件處理數據，通過標準曲線方程計算樣品的相對分子質量及其分布。 色譜條件：色譜柱TSKgel 2000SWXL（300 mm×7.8 mm），流動相V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=40∶60∶0.1，UV 檢測波長220 nm， 流量0.5 mL/min，柱溫30 ℃。

1.3.4 游離氨基酸的測定 取液體樣品3 mL，用三氯乙酸（10 g/dL）稀釋3 倍后于室溫下超聲20 min，以10000 r/min 離心10 min。取400 μL 上清液進樣檢測。色譜條件：色譜柱ODS Hypersil（250 mm×4.6 mm×5 μm），柱溫40 ℃；流動相：A 相為0.6 mmol/L乙酸鈉，B 相為0.15 mmol/L 醋酸鈉、甲醇、乙腈（體積比1∶2∶2）；流量為1.0 mL/min[13]。

1.3.5 揮發性風味成分分析 稱3.0 g 樣品于15 mL 氣質瓶中，加入2 μL 1，2-二氯苯甲醇內標溶液（0.056 μg/mL），混勻后迅速密封。采用75 μm CAR/PDMS 萃取頭于50 ℃下萃取30 min，250 ℃解吸3 min。 氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-WAX；載氣He，流量1.8 mL/min，不分流；程序升溫初始柱溫40 ℃，保持3 min，5 ℃/min 升溫至90 ℃，再以10 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持7 min；檢測口溫度250 ℃。質譜條件：EI 電離源，電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃；燈絲發射電流35 μA， 檢測器電壓1000 V， 掃描范圍m/z 35～450[13]。

1.3.6 數據分析 采用Unscramber version 9.7 進行偏最小二乘回歸（PLSR）分析，其中PLS2 用于多個因變量與多個自變量之間的相關性分析，PLS1 用于多個自變量對一個因變量的顯著性影響分析。 使用SPSS 19.0 軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同溫度和時間下美拉德反應產物風味特性的差異

感官評定是食品風味分析中最真實且直接的方法。 采用感官評定對美拉德反應產物風味特性進行分析，可以對其整體風味和各指標的差異做出直觀的判斷。 不同反應溫度和時間下美拉德反應產物的感官評定結果如圖1 所示。 溫度過低及時間過短會導致反應不完全，這使得體系中會形成明顯的生糧食味，100、110 ℃以及60 min 條件下所產生的異味主要來源于此， 除異味以外其他指標評分均不高，導致整體可接受性較差。 隨著反應溫度的升高和時間的延長， 玉米肽美拉德反應產物的肉香味、醇厚味、持續性和焦香味均不斷增強。 這是因為許多風味物質需要一定溫度與時間反應生成，當其累積達到一定量才能形成特定的風味輪廓。 有研究表明，美拉德反應過程中形成的含硫化合物，如噻吩和噻唑類化合物對肉香味的形成具有重要貢獻[14]。醇厚味是指樣品中的濃厚感和復雜感，與味道的持久性相關。 當反應溫度達到120 ℃、 時間延長至120 min 及以上時， 美拉德反應產物的肉香味和醇厚味明顯增強。 焦香味則來源于呋喃和呋喃酮等風味物質，主要是由高溫促進焦糖化反應及碳水化合物的降解反應所形成[15]。 但溫度過高或者反應時間過長又會導致焦糊味和苦味的產生， 溫度超過140℃或者反應超過150 min 的美拉德反應產物正是由于受此不良異味的影響，導致整體接受性較差。 有研究發現， 豬骨蛋白質美拉德反應產物在反應40～60 min 時風味最好，時間過長會產生明顯的糊味和硫臭味[16]。 因此合理控制反應溫度和時間對于玉米肽美拉德反應產物的感官特性非常關鍵，感官評價結果顯示， 于120 ℃溫度下反應120 min 可以制備風味特性良好的玉米肽美拉德反應產物。

圖1 溫度與時間對美拉德反應產物感官特性的影響Fig. 1 Effect of temperature and time on the sensory characteristics of Maillard reaction products

2.2 美拉德反應過程中相對分子質量分布的變化

感官評定法雖然直接、真實且靈敏，但無法解釋食品風味的化學本質，結合分子感官技術一起分析，才能更準確地對食品風味進行全面解析。 采用液相色譜對相對分子質量分布進行分析，能明晰美拉德反應過程中肽的降解或交聯規律，更準確地評價終產物的風味特性。 不同反應溫度和時間下美拉德反應產物的相對分子質量分布結果如表1 所示。由表可知， 玉米肽美拉德反應產物中相對分子質量＜1000 的組分隨反應溫度升高，相對含量顯著增加， 隨著反應時間的延長由95.73%逐漸增加至96.65%，說明升高反應溫度和延長時間均能加速肽的降解，釋放出更多相對分子質量較小的肽和游離氨基酸。當反應溫度從100 ℃上升至140 ℃時，相對分子質量1000～5000 組分的相對含量減少了1.35%，說明該相對分子質量范圍的肽發生了降解，或相互交聯形成更大相對分子質量產物，導致此肽段比例略微下降。 120 min 之前相對分子質量1000～5000 組分相對含量不斷下降， 之后趨于穩定，說明在該時間點前，相對分子質量1000～5000的肽段反應活性較強， 超過120 min 之后達到了降解與交聯的動態平衡。 相對分子質量＞5000 的組分相對含量隨著溫度的升高與時間的延長，變化趨勢較為一致，均呈現略微下降的趨勢，但總體變化幅度僅有0.27%和0.26%， 可能是由于小分子肽段的交聯與大分子肽段的降解反應達到了動態平衡，使得該組分變化不大。

表1 不同反應溫度與時間下美拉德反應產物相對分子質量分布的變化Table 1 Changes of relative molecular weight distribution of Maillard reaction products under different reaction temperature and time

綜上可知，所有樣品中相對分子質量＜1000 的組分所占比例最大，其次是相對分子質量1000～5000 和相對分子質量＞5000 的組分， 說明在此美拉德反應體系中降解反應占據了優勢。 這與牛肉酶解物-木糖美拉德反應體系的研究結果相一致[17]，即隨反應溫度的升高，肽相對分子質量分布向小肽方向轉移。Su 等研究也表明多肽在美拉德反應中同時存在聚合和降解兩種反應[18]。 肽在美拉德反應過程中存在兩種轉化方式，一是直接參與美拉德反應生成風味物質，即肽交聯作用；而另外一種途徑則是通過熱降解產生一些小分子物質，這些小分子物質再參與美拉德反應形成風味物質，即肽降解作用。

2.3 美拉德反應參數對游離氨基酸組成的影響

相比于相對分子質量分布，游離氨基酸含量及組成更能顯著影響美拉德反應產物的滋味感官特性[19]。 對不同溫度和時間下的美拉德反應產物進行游離氨基酸分析，結果如圖2 所示。 由圖可知，美拉德反應體系中游離氨基酸的質量濃度隨著反應溫度的升高和時間的延長， 有著較為一致的變化趨勢。 半胱氨酸作為底物參與反應，其變化幅度最大，從100 ℃的0.75 mg/mL 降至140 ℃的0.08 mg/mL，表明溫度升高會加快半胱氨酸的消耗速率，提高其利用率。 這與曹長春等研究的反應溫度對“半胱氨酸-木糖”體系的影響[20]結論相一致。 說明反應溫度是影響底物活性的重要因素之一，高溫條件使得非質子化半胱氨酸質量濃度增加，利于反應發生[21]。而隨著時間從60 min 延長至180 min， 半胱氨酸質量濃度逐漸下降，由于半胱氨酸對低分子肽之間交聯的抑制和對高分子肽降解的促進作用[10]，導致其他游離氨基酸的質量濃度隨時間延長而逐漸增多，這與相對分子質量分布隨時間延長的變化情況相呼應。

圖2 溫度與時間對體系中游離氨基酸組成與質量濃度的影響Fig. 2 Effect of temperature and time on the composition and mass concentration of free amino acids

Ser、Ala、Thr、Gly、Pro、Lys 等屬于甜味氨基酸。Ile、His、Phe、Leu、Val、Arg、Met、Tyr 由于其疏水性較大，呈苦味[22]。而高濃度的Glu 和親水性氨基酸殘基會形成具有鮮味口感的肽[23]，因此Asp 和Glu 屬鮮味氨基酸。 如圖可知，隨著溫度的升高和時間的延長，甜味氨基酸與苦味氨基酸質量濃度均呈現先升高后略微降低的趨勢， 分別于120 ℃和120 min 時達到最高。 隨著反應溫度的升高，鮮味氨基酸質量濃度逐漸上升，于140 ℃時達到了0.187 mg/mL。 當反應時間從60 min 延長至120 min 時，鮮味氨基酸質量濃度上升幅度較大，之后則趨于平緩。 游離氨基酸的組成、含量與比例，對食品滋味有重要的影響， 多種氨基酸協同存在才能產生豐富的味感，可以通過改變溫度與時間對美拉德反應進行調控，進而獲得目標呈味產物。

2.4 反應溫度與時間對關鍵揮發性風味成分的影響

揮發性化合物是美拉德反應產物香氣的重要組成部分，決定其整體氣味輪廓，常作為評價風味特性的首要因素。 采用SPME-GC-MS 對美拉德反應產物進行分析，研究不同加熱溫度和時間對其揮發性風味成分的影響。 為便于分析，根據文獻報道選取關鍵揮發性風味成分進行討論，如表2 所示。

表2 反應溫度與時間對美拉德反應產物中關鍵揮發性風味成分的影響Table 2 Effect of reaction temperature and time on the key volatile flavor compounds of Maillard reaction products

通過比較發現，不同反應溫度下的產物，其關鍵揮發性成分的種類及質量分數不盡相同。 其中含氮和含硫化合物的種類及質量分數均隨溫度的升高呈增加趨勢，這是由于較高的反應溫度有利于提高半胱氨酸和羰基化合物的降解和交聯反應，促進一些含硫及含氮化合物的聚合[24]。 具有肉香特征風味的噻吩、噻唑及二硫化物類化合物，由含硫氨基酸和美拉德反應中間體反應生成，隨溫度升高質量分數不斷增多， 如檢測到的3-甲基噻吩、3-噻吩甲醛、5-甲基-2-噻吩甲醛和2，5-噻吩二甲醛等僅在溫度達到120 ℃及以上時才生成，因此高溫下制備的玉米肽美拉德反應產物， 具有更突出的肉香味。吡嗪、吡咯類含氮化合物通常具有堅果、烤香和焦香等特征風味。 在溫度高于120 ℃的美拉德反應產物中檢測到的2-甲基吡嗪和1-糠基吡咯， 隨溫度的升高而逐漸增多。 呋喃類化合物是由還原糖經脫水、分解以及環化一系列步驟形成的[25]，含硫呋喃類化合物具有明顯肉香特征，不含硫的呋喃類化合物則是焦糖香風味的主要貢獻者。 結果表明，該類物質在120 ℃及以上制備的美拉德反應產物中才檢測出，生成量隨溫度的升高而逐漸增加。 醛類化合物主要來源于脂肪氧化及氨基酸的降解，檢測到的醛類物質主要為異戊醛和苯甲醛，以及少量呈青草氣味的己醛。 醇類化合物的風味閾值相對較高，在整體風味中起協同作用，主要以正己醇、薄荷醇和糠醇為主， 作為風味前體物質參加到后期的反應中。 除此以外，還檢測到大量的酮類、酚類、酸類等化合物， 反應溫度對其生成量也具有一定的影響。雖然這些物質對風味沒有直接的貢獻，但其中的部分化合物是形成雜環化合物的重要中間體，因此可以為整體風味的形成奠定基礎[26]。

反應時間對關鍵揮發性風味成分的影響也較為顯著。 時間控制在120 min 以內的玉米肽美拉德反應產物中各類揮發性成分的生成量相當，當反應達到150 min 時，各類化合物的生成量大幅度上升，產生了非常明顯的變化。 不同反應時間制備的美拉德反應產物中，含氮化合物、不含硫呋喃類化合物、含硫化合物以及醛類、醇類和酚類化合物，其生成量與時間呈正相關。 此外，有機酸的生成量隨反應時間的延長有所上升，這也是美拉德反應體系在反應過程中pH 不斷下降的主要原因。 酯類和酮類化合物的生成量是隨反應時間的延長，呈現出先增多后減少的趨勢。 這與何保江等研究的時間對Maillard 模型體系揮發性產物的影響[27]結果相一致。說明過長的反應時間會導致部分揮發性成分的分解或再反應，最終影響其呈香特性。 總的來說，反應時間對揮發性風味成分的生成具有一定的影響，時間過短不足以形成某些化合物，但若一味地延長反應時間，又會導致部分化合物的過度積累或分解，使得風味物質失衡，最終影響總體的風味輪廓。

2.5 風味成分對感官特性的貢獻性分析

2.5.1 風味成分與感官特性的相關性分析 采用PLSR 方法分析各樣品的風味成分與感官特性之間的相關性，以相對分子質量分布、游離氨基酸（FAA）質量濃度、 各類揮發性化合物質量分數作為X 變量，以感官評分作為Y 變量。 根據RMSE 值和解釋方差大小確定3 為最優主成分個數， 建立了PC1-PC2 和PC2-PC3 模型，分析發現PC2-PC3 模型提供的可用相關性信息包含于PC1-PC2 分析模型中，因此只討論PC1-PC2 模型。圖3 所示為相關性分析載荷圖，PC1-PC2 模型對X 變量解釋方差達74%，對Y 變量解釋方差為70%。 圖中，兩個橢圓分別代表PLSR 模型50%與100%的解釋方差，標記有小圓圈的為具有顯著性的變量。 從圖中可以看出，相對分子質量1000～5000、＞5000 肽段沿著PC1 均分布于載荷圖左側，相對分子質量＜1000 肽段、FAA 質量濃度、各類揮發性化合物質量分數及感官指標均分布于載荷圖右側，說明游離氨基酸、揮發性化合物等相對分子質量較小的組分與感官特性的相關性較大。 沿著PC2 軸方向，所有風味成分自下而上分布，而感官指標除異味外，均位于下方。 所有的X和Y 變量都位于R2=50%和R2=100%的橢圓之內，說明PLSR 模型能夠對各樣品的風味成分及其感官特性具有良好的解釋能力。

圖3 風味成分與感官特性的PLSR 相關分析載荷圖Fig. 3 PLSR correlation loadings plot for flavor components and sensory characteristics

2.5.2 風味成分對感官特性的顯著性影響分析為進一步明確樣品的風味成分對感官指標的顯著性影響，進行PLS1 分析，其中圖4 中灰色柱形圖表示為顯著性相關。如圖4（a）所示，呋喃類、含硫以及酮類化合物與肉香味表現出顯著的正相關。 酮類化合物對反應產物肉香味的形成必不可少[28]。 含硫的雜環化合物對烤香和肉香具有很大貢獻，有研究表明含硫呋喃類物質是對肉類風味形成作用最大的化合物[29]。除關鍵揮發性風味成分以外，相對分子質量＜1000 肽段和FAA 質量濃度也與肉香味呈顯著正相關， 相對分子質量1000～5000 肽段與肉香味呈顯著負相關，說明許多小分子氨基酸和肽對于肉味的形成具有一定貢獻。 圖4（b）顯示，呋喃類化合物與焦香味呈顯著正相關， 這與Tressl 等研究的結論[25]相一致，醛類和醇類與焦香味呈顯著負相關；相對分子質量＜1000 肽段和FAA 質量濃度對焦香味有顯著貢獻，說明美拉德反應對焦香味的形成具有舉足輕重的作用。由圖4（c）和（d）可知，風味成分對醇厚味和持續性的貢獻較為一致，醇厚味與持續性均與相對分子質量＜1000 肽段呈顯著正相關，而與相對分子質量1000～5000 肽段呈顯著負相關，這是由于醇厚味描述的是樣品濃厚的復雜感，與味道的持久性相關。 圖4（e）顯示，含硫化合物與異味呈顯著正相關，有研究發現美拉德反應產物的異味大多是一種焦糊味與硫臭味[16]。

圖4 風味成分對感官特性的顯著性影響分析Fig. 4 Analysis of the significant influence of flavor components on sensory characteristics

3 結語

以玉米肽-木糖-半胱氨酸為反應體系，考察了反應溫度和時間對美拉德反應產物風味特性的影響。 結果表明，隨著溫度的升高和時間的延長，肉香味、醇厚味和焦香味均有所提升，溫度在120～130 ℃，時間在120～150 min 感官整體接受度評分較高。 溫度的提高促進了體系的降解反應，提高了半胱氨酸的消耗速率，使得呈味氨基酸總量逐漸上升，含氮、含硫化合物以及呋喃類、酸類、酚類物質的種類及質量分數不斷增加。 反應時間的延長亦能在一定程度上增強玉米肽美拉德產物的風味特性，其呈味氨基酸總量的變化、 關鍵揮發性風味成分的累積趨勢， 均與溫度升高對風味特性的影響效果相類似，尤其是150 min 之后揮發性風味成分的種類及質量分數大幅度增加。 風味成分的組成是影響感官特性的最直接因素，PLSR 分析結果表明，多種關鍵揮發性風味成分、 游離氨基酸質量濃度和相對分子質量＜1000 的肽段對肉香味和焦香味的形成具有積極顯著的貢獻，相對分子質量＜1000 的肽段與醇厚味和持續性呈顯著正相關，而含硫化合物則對異味具有重要影響。 該研究可為不同風味特性玉米肽美拉德反應產物的定向制備提供理論基礎。