卵白蛋白和大豆分離蛋白相互作用對凝膠結構及性質的影響

唐婷婷， 楊玲玲， 蔣 艷， 涂勇剛， 徐明生

（江西農業大學 江西省農產品加工與質量控制工程實驗室，江西 南昌 330045）

大豆分離蛋白 （Soybean protein isolate，SPI）由于具有良好的乳化性、 填充性以及凝膠性等性質，在食品中應用廣泛[1]。 有研究發現在肉糜類產品中添加改性大豆分離蛋白可以改善肉的凝膠性，顯著提高豬肉肌原纖維蛋白凝膠的彈性和硬度，顯著提高制品的含水率和蒸煮產量[2-4]。 加熱條件下，大豆分離蛋白的多肽鏈展開暴露更多的作用位點，然后發生聚集形成凝膠網絡結構。 大豆分離蛋白的主要成分7S 球蛋白和11S 球蛋白 （占總蛋白質質量的65%～80%）是通過氫鍵和二硫鍵形成的致密的球狀結構，所以天然的大豆分離蛋白分子柔性較低[5]，且采用堿提酸沉和噴霧干燥等手段進行商業化生產，使部分蛋白質發生變性，凝膠性降低[6]。 因此，改善大豆分離蛋白的凝膠性，對其在食品加工中的應用至關重要。

兩種蛋白質復合是一種簡單方便、經濟有效的方法，可以提高蛋白質的功能特性[7-9]。 當兩種蛋白質復合后，如果其中一種蛋白質的濃度在自身可形成凝膠的臨界濃度下，該蛋白質可能在復合凝膠中作為非凝膠組分，形成填充凝膠。 當復合蛋白質之間產生了物理結合，作為非凝膠組分的蛋白質可能會通過非特異性的相互作用隨機吸附在連續相蛋白質凝膠網絡上，或是發生共聚合形成雜合的凝膠網絡，又或是不同的蛋白質之間完全兼容形成相互穿插的聚合網絡[7-8]。 不同種類蛋白質復合可以得到性能更好的凝膠。

卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）是蛋清中含量最豐富的蛋白質，約占總蛋白質質量的54%，屬于球狀蛋白質的一種，其三級結構包括排列在外部的親水氨基酸和主要排列在三級結構內部的疏水氨基酸，含量（質量分數）達到50%以上，相對分子質量約為45000， 每個蛋白質分子含有4 個游離巰基和1 個二硫鍵[10]。卵白蛋白因其較好的保水性和凝膠性、良好的經濟性在食品工業中應用廣泛。 有研究表明使用卵白蛋白粉，在不增加成本前提下，能夠改善肉糜制品的凝膠強度，使產品的風味更好，提高出品率[11]；在魚糜制品中添加質量分數2%的卵白蛋白粉可以提高魚糜的凝膠強度[12]。 Su 等研究了不同配比和蛋白質濃度下大豆分離蛋白和蛋清復合凝膠的性質和二級結構，發現在大豆分離蛋白與蛋清質量比為1∶1 時，形成的凝膠結構均勻、顆粒較小，彈性和保水性有較高的提高[8]。 基于此，作者選擇蛋清中的主要蛋白質卵白蛋白為添加物，通過在大豆分離蛋白中添加卵白蛋白，測定游離巰基、表面疏水性和分子間作用力，研究卵白蛋白和大豆分離蛋白相互作用對凝膠結構和性質的影響，為大豆分離蛋白在食品加工中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

卵白蛋白、甘氨酸、DTNB：美國Sigma 試劑公司產品；大豆分離蛋白：山東山松生物公司產品；戊二醛、尿素：國藥集團化學試劑有限公司產品；β-巰基乙醇：北京鼎國昌盛生物技術公司產品。

1.2 卵白蛋白和大豆分離蛋白溶液的配制

分別制備質量分數為10%的卵白蛋白（OVA）溶液和質量分數為10%大豆分離蛋白（SPI）溶液，pH 調至中性，4 ℃過夜保存。參考文獻[8]的方法，將卵白蛋白溶液和大豆分離蛋白溶液按質量比1∶1 混合，總固形物質量分數為10%，溶液混合均勻后放入4 ℃冰箱過夜備用。

1.3 復合凝膠的制備

將配制好的復合蛋白質溶液（OVA-SPI 溶液），置于恒溫水浴槽中于85 ℃加熱30 min， 待凝膠形成后迅速冷卻， 制好的凝膠樣品于4 ℃下放置過夜，待用。

1.4 蛋白質游離巰基質量摩爾濃度的測定

根據Jia 等的方法確定游離巰基（SH）質量摩爾濃度[13]。 在0.5 mL 卵白蛋白溶液、大豆分離蛋白溶液和復合蛋白質溶液中加入8 mol/L 尿素、10 mmol/L EDTA、0.1 mol/L KH2PO4（pH 為6.0） 和100 μL Ellman 試劑，將混合物置于室溫下25 min，用紫外可見分光光度計在412 nm 處測量吸光度， 游離巰基基團的摩爾消光系數為13600 mol/（L·cm）。游離巰基質量摩爾濃度的計算：

式中：bSH為游離巰基質量摩爾濃度，μmol/g；73.53經單位換算得到1×106/1.36×104mol/（L·cm）；A412nm為所測定的紫外可見分光光度吸收度；D 為稀釋因子；C 為樣品上清液的蛋白質質量濃度，mg/mL。

1.5 表面疏水性的測定

根據參考文獻[14]的方法，稍有修改。以1-苯胺萘-8-磺酸（ANS）為疏水熒光探針。 將凝膠溶液（1 mg/mL）稀釋成一系列不同蛋白質質量濃度的溶液， 質量濃度范圍為0.1～0.5 mg/mL。 將25 μL（8 mmol/L）ANS （0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 6.0）溶液加入5 mL 樣品，混合均勻，在25 ℃下避光20 min，使用熒光分光光度計在激發波長374 nm 和發射波長485 nm 下測量混合物的熒光強度。 熒光強度隨蛋白質質量濃度變化曲線的初始斜率稱為S0-ANS。

1.6 分子間作用力的測定

將蛋白質凝膠分別溶解在4 種溶劑中，其中S1溶液為0.6 mol/L NaCl，S2 溶液為0.6 mol/L NaCl 和1.5 mol/L 尿素，S3 溶液為0.6 mol/L NaCl 和8 mol/L尿素，S4 溶液為0.6 mol/L NaCl、8 mol/L 尿素和0.5 mol/L β-巰基乙醇。 取0.3 g 的樣品溶解于2.7 mL S1 溶液中，12000 r/min 均質1 min， 靜置30 min，10000 r/min 離心20 min。 S1 溶液的沉淀物溶解于2.7 mL 的S2 溶液中，重復上述過程。 對S3 溶液和S4 溶液以相同的方法進行操作。 收集各上清液，用雙縮脲法測定上清液中的蛋白質質量。 上清液中的蛋白質質量即為蛋白質凝膠的溶解度。

1.7 微觀結構的測定

使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察復合凝膠的微觀結構， 將制成的凝膠樣品切成厚度約為5 mm 的薄片， 置于體積分數為2.5%的戊二醛固定液（0.1 mol/L pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液）固定2 h，沖洗多次除去殘余的有機試劑， 再用體積分數60%～10%梯度的乙醇溶液洗脫，每次10 min，再冷凍干燥、噴金處理，進行觀察。

1.8 二級結構的測定

采用溴化鉀（KBr）壓片法進行樣品的紅外光譜分析。 將干燥后的凝膠樣品與溴化鉀粉末進行混合，研磨后壓成透明薄片，在400～4000 cm-1波長內進行掃描，以4 cm-1的分辨率進行32 次掃描。 使用OMNIC 6.0 數據收集軟件分析光譜數據[15]。

1.9 凝膠保水性的測定

稱取約8 g 的樣品放入離心管后稱取總質量，于4 ℃、5000 r/min 離心15 min， 瀝凈水分后稱質量。 保水性（WHC）計算公式如下：

式中：BWHC為保水性，%；m0為離心管質量，g；m1為離心前凝膠和離心管總質量，g；m2為離心后凝膠和離心管總質量，g。

1.10 凝膠的質構測定

對樣品進行TPA 分析，主要參數為：探頭類型為P/36R，測前速度為3.0 mm/s，測中速度和測后速度為5 mm/s，壓縮比為40%，觸發力為5 g。 每個樣品重復6 次，取平均值。

1.11 數據分析

結果使用SPSS 進行統計分析， 所有數據均以平均數±標準差表示。 采用單因素方差分析（ANOVA） 確定統計學差異。 平均數比較采用Duncan 檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 凝膠的理化性質

2.1.1 蛋白質溶液的游離巰基質量摩爾濃度 游離巰基是蛋白質中最活躍的基團，位于蛋白質分子表面，氧化后可以形成新的二硫鍵，在維持復合蛋白質結構穩定性方面起著重要作用[16]。 OVA 溶液、SPI 溶液與OVA-SPI 溶液中的游離巰基質量摩爾濃度如圖1 所示。 由圖1 可知，OVA-SPI 溶液中游離巰基的質量摩爾濃度顯著低于OVA 溶液 （P＜0.05），顯著高于SPI 溶液（P＜0.05）。 一個卵白蛋白分子含有4 個游離巰基，大豆分離蛋白中游離巰基較少，兩者復合后，溶液中的游離巰基質量摩爾濃度則低于卵白蛋白溶液，高于大豆分離蛋白溶液。

圖1 蛋白質溶液的游離巰基質量摩爾濃度Fig. 1 Free sulfhydryl content in protein solution

2.1.2 凝膠的表面疏水性 表面疏水性是表征蛋白質分子表面與極性水環境接觸的疏水基團數目的指標，與蛋白質分子的功能性質密切相關[17]。OVA凝膠、SPI 凝膠和OVA-SPI 凝膠的表面疏水性如圖2 所示。大豆分離蛋白與卵白蛋白結合后，凝膠的表面疏水性顯著降低，是由于大豆分離蛋白與卵白蛋白結合過程中三級結構展開，并發生一系列的結構折疊變化，從而將大量疏水基埋藏在蛋白質內部[18]，表明大豆分離蛋白與卵白蛋白之間通過疏水作用結合。

圖2 凝膠的表面疏水性Fig. 2 Surface hydrophobicity of the gel

2.1.3 凝膠的分子間作用力 蛋白質聚集通常是通過對球狀蛋白質進行熱處理來實現的，在變性溫度以上加熱會導致蛋白質部分展開，從而暴露先前埋藏在其結構內的基團，促使蛋白質之間通過疏水相互作用、氫鍵和二硫鍵形成不同分子間的聚集[19]。蛋白質分子間的作用力不同，形成凝膠的微觀結構也會存在差異。 如圖3 可知，離子鍵和二硫鍵是卵白蛋白形成凝膠的主要分子間化學力，疏水相互作用和離子鍵是大豆分離蛋白形成凝膠的主要作用力，而在復合凝膠中起作用的則主要是疏水相互作用和二硫鍵，說明不同種類蛋白質復合會改變分子間的相互作用。

圖3 分子間作用力的變化Fig. 3 Changes in intermolecular forces

在S1 溶液中，與OVA 凝膠和SPI 凝膠相比，復合凝膠的溶解度下降，是由于蛋白質間的靜電吸引增強。 在實驗pH 條件下（pH 7.0），整個體系帶負電荷，離子鍵的減小，說明蛋白質間的電荷減少，兩種蛋白質分子間出現了靜電引力，導致蛋白質分子間的排斥力下降[15]。在S2 溶液中復合凝膠的溶解度顯著高于OVA 凝膠， 表明卵白蛋白和大豆分離蛋白之間通過氫鍵相互結合，或者卵白蛋白的添加可能促進了大豆分離蛋白分子間的氫鍵相互作用。 疏水相互作用是評價蛋白質結構變化的常用指標，是支撐凝膠結構的一部分，與最終凝膠的性質密切相關[17]。在S3 溶液中，復合凝膠的溶解度顯著高于OVA 凝膠，說明疏水相互作用是復合蛋白質形成凝膠的主要作用力。 二硫鍵的含量對凝膠的形成很重要。 在S4 溶液中，復合凝膠的溶解度顯著低于OVA 凝膠，這與游離巰基質量摩爾濃度的實驗結果一致。 原因是卵白蛋白中游離巰基含量最多，在加熱形成凝膠的過程中， 游離巰基基團發生SH-SS 交換反應，凝膠網絡形成，二硫鍵增加。 但是卵白蛋白中二硫鍵交聯過于明顯，會產生不可逆的凝膠，導致凝膠硬度較大。 綜上，與OVA 凝膠相比，將卵白蛋白和大豆分離蛋白復合后，降低了蛋白質分子間的離子鍵和二硫鍵，提高了疏水相互作用和氫鍵。

2.2 凝膠的二級結構

凝膠網絡結構與蛋白質二級結構具有密切的關聯性（見圖4），其中圖4（b）為1600～1700 cm-1的二階導數圖譜。 位于酰胺Ⅰ帶C=O 和N—H 之間氫鍵性質的不同而引起的不同的振動頻率可以反映蛋白質或多肽的α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲等結構[20]。 其中酰胺Ⅰ帶中的各個峰對應于以下的二級結構：1650～1659 cm-1對應α-螺旋，1640～1610 cm-1對應β-折疊，1660～1700 cm-1對應β-轉角，1650～1640 cm-1與無規則卷曲有關[21]。由圖4 可知，OVA 凝膠、SPI 凝膠和復合凝膠在3300 cm-1附近都有一比較明顯的吸收峰， 該峰是由蛋白質—OH、N—H 伸縮振動產生的。 在4000～400 cm-1波長范圍內可以看到，OVA 凝膠、SPI 凝膠以及復合凝膠的紅外光譜吸收峰沒有明顯的差異，在二階導圖中發現蛋白質二級結構有顯著變化。 3種凝膠的二級結構主要是分子內β-折疊和分子間β-折疊，復合凝膠分子間β-折疊吸光度下降，并伴隨著分子內β-折疊強度增強，說明兩種蛋白質分子間發生了相互作用，形成了更穩定的結構。 有研究表明α-螺旋與β-折疊結構的比例越低， 凝膠中自由水含量越低，結合水含量越高，凝膠保水性和強度更理想[22]，在3 種凝膠中，復合凝膠的α-螺旋與β-折疊結構的比例最低，其次是OVA 凝膠，最后是SPI 凝膠，這與保水性和質構的實驗結果一致。 說明合適比例的卵白蛋白和大豆分離蛋白復合能促進蛋白質分子間的相互作用、 二級結構間的轉化，形成結構均勻、保水性強的凝膠。

圖4 凝膠的二級結構Fig. 4 Secondary structure of the gel

2.3 凝膠的微觀結構

通過對OVA 凝膠、SPI 凝膠以及復合凝膠的微觀結構進行觀察，分析蛋白質相互作用對凝膠結構的影響。 由圖5 可知，OVA 凝膠、SPI 凝膠和復合凝膠內部形態有明顯的不同。 影響蛋白質凝膠性質的主要因素有環境條件（如pH、離子強度和礦物質含量）、蛋白質組成、變性程度和濃度、加工條件（如加熱和冷卻速度）[23]。 電鏡圖像顯示：OVA 凝膠在結構上有許多小孔， 表面較為光滑；SPI 凝膠結構粗糙，顆粒較大；復合凝膠結構致密，均勻性增加，填充顆粒呈線性結構，該結構的凝膠具有高彈性。SPI 凝膠結構粗糙是因為大豆分離蛋白主要由7S 和11S 球蛋白組成，兩種蛋白質的變性溫度存在差異，在實驗設定溫度下（85 ℃），7S 球蛋白發生變性，而11S球蛋白由于含有大量的二硫鍵（每個分子18～20 個二硫鍵），導致分子緊密折疊，在85 ℃下未完全變性，沒有完全溶解和展開的11S 球蛋白可能會摻雜在凝膠網絡結構中，形成結構粗糙的凝膠[8]。 由于卵白蛋白（相對分子質量45000）與大豆分離蛋白（7S球蛋白相對分子質量為140000～190000，11S 球蛋白相對分子質量為300000～400000） 在分子大小和相互作用上的差異，卵白蛋白可以填補大豆分離蛋白的大分子缺口，使復合凝膠結構致密、均勻性好，這和Luo 等的實驗結果一致[24]。 同時，復合凝膠中的不溶性固體作為非凝膠組分，散布在三維網絡中，形成結構致密的凝膠。 有研究表明，乳清分離蛋白和大豆分離蛋白按照質量比1∶1 復配形成的復合凝膠網絡結構的均勻性和有序性顯著高于大豆分離蛋白凝膠[25]。 說明不同蛋白質復合可以改善大豆分離蛋白凝膠的微觀結構，形成均勻有序的凝膠。

圖5 凝膠的微觀結構Fig. 5 Microstructure of the gel

2.4 凝膠的保水性

蛋白質類食品的吸水能力和防止其在外力作用時滲出水分的能力（所謂的保水性）對食品的質地和口感至關重要[26]。如圖6 所示，復合凝膠的保水性高于OVA 凝膠和SPI 凝膠。 這與Comfort 等的研究結果[27]相似，均是在特定比例下出現了蛋白質間的協同增強效應。 有研究表明蛋白質凝膠的保水性通常取決于凝膠的硬度和微觀結構，具有細小結構的凝膠比粗糙的凝膠具有更高的保水能力[28]，所以復合凝膠的保水性顯著高于單一蛋白質凝膠。 由于凝膠硬度和微觀結構的相互作用，相似微觀結構的蛋白質網絡在保水性上存在差異[29]。此外，蛋白質的保水性、凝膠性還與溶液中蛋白質和水相互作用直接相關，復合凝膠可以通過提高溶液中蛋白質和水的相互作用改善自身保水性。

圖6 凝膠的保水性Fig. 6 Water holding capacity of the gel

2.5 凝膠的硬度和彈性

硬度和彈性是分析食品組織特性時常用的參數[30]。OVA 凝膠、SPI 凝膠以及復合凝膠的質構如圖7 所示。 由圖7 可知， 復合凝膠的硬度高于SPI 凝膠，是由于二硫鍵的增強使卵白蛋白和大豆分離蛋白之間交聯增加，以及蛋白質分子之間氫鍵的形成[30]。 這一結果表明，在中性條件下，可以通過添加卵白蛋白提高大豆制品的硬度。

彈性是指凝膠在解壓后恢復到原來形狀的程度[31]。 如圖7 所示，復合凝膠的彈性高于OVA 凝膠和SPI 凝膠，與保水性的結果相一致。卵白蛋白的變性溫度較低，受熱后蛋白質分子優先聚集，而過快的聚集速度會導致分子鏈還未完全展開就發生隨機交聯形成結構較為粗糙的凝膠，導致彈性較低[32-33]。有研究報道大豆蛋白中的7S 球蛋白主要影響蛋白質凝膠的黏彈性，11S 球蛋白主要影響凝膠硬度，在本研究的加熱溫度下（85 ℃），11S 球蛋白未完全變性，導致產生的凝膠硬度較低[8，34]。 卵白蛋白和大豆分離蛋白復合后凝膠的彈性更好，原因是大豆分離蛋白由比卵白蛋白大得多的亞基組成，卵白蛋白可以被大豆分離蛋白包圍，包裹體具有更好的蛋白質相互作用機會，能適當促進蛋白質的聚集，提高凝膠的彈性和保水性。

圖7 凝膠的硬度和彈性Fig. 7 Hardness and elasticity of the gel

3 結語

在大豆分離蛋白中添加一定比例的卵白蛋白顯著提高了SPI 溶液的游離巰基， 兩種蛋白質主要通過疏水相互作用和二硫鍵形成聚集物，將疏水基團包埋在其內部，降低了SPI 凝膠的表面疏水性，形成結構致密、均勻好的凝膠，提高了凝膠的硬度、彈性和保水性。 兩種蛋白質復合是提高蛋白質凝膠性以及在食品工業中應用的一種有效的方法。