玉米糖肽的納濾脫鹽工藝

夏春榮， 王曉杰， 曲 悅

（齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院/黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

轉谷氨酰胺酶（TGase）在食品工業中被廣泛應用，如乳品、肉類、烘焙食品等加工領域[1]。 根據酰基受體的不同，TGase 可以催化3 種類型反應：交聯反應、脫酰基反應和酶法糖基化反應。 在酶法糖基化反應中，由含有伯胺基團的糖作為酰基受體[2]。 目前，TGase 催化的酶法糖基化反應已經成功應用于多種食物蛋白質和多肽的改性中，如酪蛋白、大豆蛋白質、魚皮膠原蛋白肽、小麥谷蛋白肽等。 與未糖基化的蛋白質和多肽相比，糖基化修飾產物的溶解性、表面疏水性、熱穩定性等功能性質以及抗氧化和抗菌等生物活性均顯著提高[3-8]。因此，TGase 途徑的酶法糖基化反應在改善食物蛋白質和多肽功能性質方面顯示出良好的應用潛力。

玉米糖肽是玉米蛋白質先經蛋白酶水解獲得低相對分子質量玉米肽，再在TGase 催化下與氨基糖共價結合的產物。 在乙醇誘導的大鼠亞急性肝損傷模型中，與未糖基化的玉米肽相比，玉米糖肽顯示出更高的拮抗酒精性肝損傷活性，在食品、醫藥、保健食品等領域顯現出良好的應用前景[9]。 但是，在玉米糖肽的制備過程中，為了維持蛋白酶和TGase的催化活性，在玉米蛋白質的酶法水解和糖基化過程均會因調節酸堿度而引入大量的鹽分，使玉米糖肽成為高鹽食品。 研究表明，食鹽是造成高血壓和心血管疾病的重要原因之一[10]，因此，玉米糖肽中過多的鹽分會限制其作為保健食品及食品基料在食品工業中的應用。 另外，糖基化反應體系中未反應的D-氨基葡萄糖還沒有有效去除方法， 尤其是沒有適用于工業規模生產的去除方法。 因此，為了促進玉米糖肽的開發與應用，需要從玉米糖肽中去除部分鹽分和未反應的D-氨基葡萄糖。 在眾多適合生物活性物質的脫鹽方法中，納濾因具有對單價離子截留率低、操作成本低、適合工業規模擴大、不破壞被分離物質的生物活性，同時具有脫鹽和濃縮于一體的效果等特點，已經成功應用于玉米肽、花生肽、魚皮膠原肽等生物活性肽的脫鹽處理，脫鹽率一般在42.56%～95.90%[11-15]。 另外， 納濾脫鹽處理時，反應體系中糖的存在對氯化鈉的截留率影響不大[16]，說明納濾也適用于玉米糖肽的脫鹽處理。

作者以D-氨基葡萄糖共價修飾玉米肽的產物玉米糖肽溶液為原料，以膜通量、電導率、脫鹽率、短肽回收率以及納濾后產物的自由基清除率和Fe2＋-螯合率為測量指標，確定相對分子質量200 納濾膜對玉米糖肽抗氧化活性影響較小的納濾脫鹽工藝， 同時考察納濾對反應體系中未反應D-氨基葡萄糖的去除效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TGase（酶活力1000 U/g）：泰興市一鳴生物制品有限公司產品；3，5-二硝基水楊酸： 天津市化學試劑廠制造；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：日本TCI 化成工業發展有限公司產品；D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、 菲洛嗪、硫代巴比妥酸、2-脫氧-D-核糖：上海生工生物有限公司產品；堿性蛋白酶（Alcalase，6.28×105U/mL）：丹麥諾維信公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

NDA701 凱氏定氮儀：意大利VELP 公司產品；相對分子質量200 納濾膜：GE 公司產品；PC/PLCLD-53 真空冷凍干燥機：美國MILLROCK 公司產品；DDSJ-308A 電導率儀：上海雷磁儀器廠制造；HYM-Multi-RN 多功能實驗分離機：廈門昊源膜科技有限公司產品；DF-Ⅱ氮吹儀：江蘇省金壇區醫療儀器廠制造；ICE3000 原子吸收光譜儀：賽默飛世爾科技有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 玉米糖肽的制備 玉米醇溶蛋白在底物質量濃度5 g/dL、 反應初始pH 8.5、 溫度60 ℃、Alcalase 添加質量為底物質量3%條件下水解2.0 h。 酶解結束后，酶解液經鈍化蛋白酶、離心及冷凍干燥后獲得玉米肽[9]。玉米肽在底物質量濃度3 g/dL、玉米肽與D-氨基葡萄糖的質量比1∶3、pH 7.7、TGase加酶量55 U/g（以玉米肽質量計）、溫度44 ℃條件下糖基化反應7 h， 反應物經鈍化TGase 及離心后獲得玉米糖肽溶液[8]。

1.3.2 相對分子質量200 納濾膜操作溫度和操作壓力的確定 在操作時間均為0.5 h 的條件下，考察玉米糖肽溶液通過相對分子質量200 納濾膜時膜通量隨操作溫度和壓力的變化規律，以確定相對分子質量200 納濾膜處理玉米糖肽溶液時的操作溫度和操作壓力，根據下式（1）計算膜通量。

式中：F 為膜通量，L/（m2·h）；Vp為玉米糖肽溶液經相對分子質量200 納濾膜處理后收集的透過液的體積，L；A 為相對分子質量200 納濾膜的有效面積，此處為0.38 m2；t 為納濾操作的時間，h。

1.3.3 玉米糖肽溶液相對分子質量200 納濾膜的脫鹽工藝 參照作者所在課題組前期確定的玉米肽納濾脫鹽工藝[17]，略有修改。 在納濾脫鹽工藝中，將玉米糖肽溶液的初始體積記為V0，納濾的體積濃縮倍數固定為2， 主要考察加水次數對玉米糖肽溶液脫鹽效果的影響。 第1 次納濾時，玉米糖肽溶液經相對分子質量200 納濾膜脫鹽、 濃縮至體積Vr（Vr=1/2V0），分別收集透過液和截留液；向截留液中加入蒸餾水至體積為V0，即加蒸餾水的體積與透過液的體積相同， 進行第2 次納濾， 重復納濾操作5次，通過不斷循環達到脫鹽的目的。

1）電導率的測定 取10 mL 每次納濾結束后收集的透過液和截留液，用經標準液校準的電導率儀測定電導率[13]。

2）Na＋質量分數和脫鹽率的測定 待測樣品中的Na＋質量濃度參照 《食品安全國家標準 食品中鉀、鈉的測定》（GB 5009.91—2017）中的火焰原子吸收光譜法測定，并分別根據公式（2）和（3）計算Na＋質量分數和脫鹽率。

式中：ω 為Na＋質量分數，%；Co為玉米糖肽溶液的蛋白質質量濃度，mg/L；Cn為玉米糖肽溶液中Na＋的質量濃度，mg/L；S 為脫鹽率，%；Ca為納濾截留液中Na＋的質量濃度，mg/L；Vo為玉米糖肽溶液的體積，L；Vr為納濾截留液的體積，L。

3）短肽回收率的測定 取每次納濾結束的截留液，采用Folin-酚法[18]測定可溶性蛋白質含量，根據公式（4）計算短肽回收率。

式中：G 為短肽回收率，%；Co為玉米糖肽溶液中蛋白質的質量濃度，mg/L；Cp為納濾透過液中蛋白質的質量濃度，mg/L；Vo為玉米糖肽溶液的體積，L；Vp為納濾透過液的體積，L。

4）D-氨基葡萄糖質量分數的測定 采用DNS法測定D-氨基葡萄糖的質量分數[8]。 取0.01 g 待測樣品和2.5 mL 6 mol/L HCl 放于安瓿管中， 在氮氣環境下于100 ℃酸水解7.5 h，自然冷卻至室溫后將酸水解液過濾至1.5 mL 離心管中。 在10 mL 比色管中分別加入0.8 mL 濾過液、0.7 mL 6 mol/L 的NaOH 和1.5 mL 的DNS 試劑，搖勻，沸水浴5 min使3，5-二硝基水楊酸與還原糖生成棕紅色的氨基化合物，取出后立即冷卻至室溫，向每支比色管中加入1 mL 蒸餾水，搖勻，測定540 nm 處的吸光度。以0.7 mL 蒸餾水代替樣品作空白。將測定的吸光度代入D-氨基葡萄糖標準曲線， 計算出玉米糖肽中D-氨基葡萄糖的質量分數（%）。

5）抗氧化活性的測定 取每次納濾結束加完蒸餾水的循環液進行冷凍干燥獲得玉米糖肽粉，參照《谷類、 豆類粗蛋白質含量的測定 杜馬斯燃燒法》（NY/T 2007—2011）測定總蛋白質含量。 在蛋白質質量濃度為2 mg/mL 條件下，參照文獻[19]描述的方法測定每次納濾脫鹽處理后樣品的自由基清除率和Fe2＋-螯合率。

1.3.4 統計分析 納濾脫鹽實驗重復3 次，結果以x±SD 形式表示。采用SPSS statistics 19.0 軟件，根據單因素方差（One-way ANOVA）方法對數據進行差異顯著性分析， 采用LSD 法進行組間多重比較，以P＜0.05 為差異顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 不同操作溫度對相對分子質量200 納濾膜膜通量的影響

在玉米糖肽溶液體積6.4 L、 壓力2.0 MPa、操作時間0.5 h 的條件下， 考察玉米糖肽溶液通過相對分子質量200 納濾膜時膜通量隨操作溫度的變化規律，結果如圖1 所示。 在14～20 ℃溫度下，隨著溫度的升高，相對分子質量200 納濾膜的膜通量呈逐漸增大的變化趨勢，這是因為操作溫度的升高可以降低玉米糖肽溶液的黏度， 增加溶質的擴散系數，使玉米糖肽溶液通過相對分子質量200 納濾膜時的阻力較小，納濾膜的通量增加，進而分離性能提高[12]。 但是，當操作溫度從20 ℃升高至23 ℃時，膜通量僅升高1.98%，因此，從操作成本角度考慮，選擇相對分子質量200 納濾膜處理玉米糖肽溶液的操作溫度為20 ℃。

圖1 不同操作溫度對膜通量的影響Fig. 1 Effect of different operating temperature on membrane flux

2.2 不同操作壓力對相對分子質量200 納濾膜膜通量的影響

操作壓力作為納濾分離的推動力，是影響納濾膜膜通量和使用壽命的重要因素[20]。 在玉米糖肽溶液體積6.4 L、溫度20 ℃、操作時間0.5 h 的條件下，考察玉米糖肽溶液通過相對分子質量200 納濾膜時膜通量隨操作壓力的變化規律， 結果如圖2 所示。 在納濾操作條件一定時，操作壓力對相對分子質量200 納濾膜的膜通量影響較大。 當操作壓力由1.5 MPa 升高至2.0 MPa 時， 膜通量顯著增大 （P＜0.05），可能由于操作壓力的增大加快了相對分子質量200 納濾膜表面玉米糖肽溶液的流速，提高了納濾膜對玉米糖肽的分離性能[21]；當壓力從2.0 MPa升高到2.5 MPa 時， 膜通量雖然升高9.44%， 但與2.0 MPa 時相比差異不顯著（P＞0.05），而在壓力升高至3.0 MPa 時， 膜通量與2.5 MPa 時相比顯著增加（P＜0.05）。 但是，壓力越高，在納濾膜表面的截留物越多，對納濾膜的污染越嚴重[15]，而且壓力越高，對納濾膜的損傷越嚴重。 因此，綜合考慮納濾膜的工作效率和損傷程度，選擇玉米糖肽溶液納濾脫鹽的操作壓力為2.0 MPa。

圖2 不同操作壓力對膜通量的影響Fig. 2 Effect of different operating pressure on membrane flux

2.3 相對分子質量200 納濾膜脫鹽次數的確定

2.3.1 相對分子質量200 納濾膜脫鹽次數對電導率和短肽回收率的影響 在溫度20 ℃、 壓力2.0 MPa 的條件下， 玉米糖肽溶液按1.3.3 工藝連續納濾5 次，考察截留液和透過液的電導率和短肽回收率隨納濾次數的變化情況，結果如圖3 所示。在圖3（a）中，與未納濾脫鹽處理的玉米糖肽溶液相比，當納濾次數從1 次增加到3 次時，截留液的電導率顯著降低（P＜0.05）；但當納濾次數從4 次增加到5 次時， 截留液和透過液的電導率均沒有顯著性差異（P＞0.05）；納濾5 次后，截留液的電導率與未納濾脫鹽處理的玉米糖肽溶液相比下降了60.87%，說明相對分子質量200 納濾膜5 次納濾對玉米糖肽溶液（P＜0.05）中的鹽分有較好的透過性，能有效去除玉米糖肽溶液中過量的鹽分。 由圖3（b）可以看出，與未納濾脫鹽處理的玉米糖肽溶液相比，玉米糖肽溶液的短肽回收率隨著納濾次數的增加呈顯著降低的變化趨勢。 經5 次納濾后，玉米糖肽溶液的短肽回收率為96.97%，比納濾前降低了3.03%，說明在實驗中采用的相對分子質量200 納濾膜和納濾條件下，在脫鹽的同時會有少量的蛋白質吸附在納濾膜表面，使納濾膜孔有一定程度的堵塞，同時也會有一部分相對分子質量小于200 的蛋白質組分進入透過液而損失掉。

圖3 納濾次數對電導率和短肽回收率的影響Fig. 3 Effect of nanofiltration times on electrical conductivity and recovery rate of short peptide

2.3.2 相對分子質量200 納濾膜脫鹽次數對Na＋質量分數和脫鹽率的影響 按照1.3.3 部分的工藝，玉米糖肽溶液在溫度20 ℃、壓力2.0 MPa 條件下連續納濾5 次， 考察納濾次數對Na＋質量分數及脫鹽率的影響，結果如圖4 所示。 玉米糖肽溶液中Na＋的初始質量分數為10.57%，這部分鹽分是在玉米醇溶蛋白酶法水解和玉米肽酶法糖基化反應過程中，為了維持pH 穩定滴加NaOH 產生的。 與未納濾脫鹽處理的玉米糖肽溶液相比， 在連續納濾3 次后，Na＋質量分數大幅度降低，降低了80.13%；隨后繼續增加納濾次數，Na＋質量分數趨于穩定。 玉米糖肽溶液的脫鹽率與Na＋質量分數的變化規律相反， 隨著納濾次數的增加呈逐漸增加的變化趨勢，在連續納濾5 次后，玉米糖肽溶液的脫鹽率達81.60%。 于國才等采用相對分子質量160 和相對分子質量360 的兩種納濾膜對具有醒酒活性的玉米肽進行濃縮，發現與相對分子質量360 納濾膜相比，相對分子質量160 納濾膜對Na＋具有較低的傳質效率[11]，說明在納濾脫鹽過程中， 納濾膜的孔徑對脫鹽率有很大影響。 因此，可以在保證多肽的截留率的前提下，選擇孔徑大的納濾膜提高脫鹽率。 另外，經過5 次納濾脫鹽后，玉米糖肽溶液中仍含有1.42%的Na＋，這與2.3.1 部分電導率的變化規律相一致。分析可能有兩方面的原因， 一是玉米糖肽分子中的羧基與Na＋以較強的靜電引力結合；二是隨著納濾操作的連續進行，玉米糖肽在納濾膜表面逐漸沉積，使納濾膜的分離性能降低，在循環水量不增加的前提下，導致Na＋不能被完全脫除[21]。 因此，從節約成本角度考慮，采用相對分子質量200 納濾膜連續納濾5 次基本可以達到玉米糖肽溶液脫鹽的目的。

圖4 納濾次數對Na+質量分數和脫鹽率的影響Fig. 4 Effect of nanofiltration times on Na+ mass fraction and desalinization rate

2.3.3 相對分子質量200 納濾膜脫鹽次數對玉米糖肽抗氧化活性的影響 以未納濾脫鹽處理的玉米糖肽為對照，研究相對分子質量200 納濾膜的納濾次數對玉米糖肽抗氧化活性的影響， 結果如圖5所示。由圖5（a）可知，在蛋白質質量濃度均為2 mg/mL條件下，與未納濾脫鹽處理的玉米糖肽相比，隨著納濾次數的增加，玉米糖肽的DPPH 自由基清除率呈逐漸降低的變化趨勢，在納濾5 次后，玉米糖肽的DPPH 自由基清除率降低11.83%，但與未納濾脫鹽處理的樣品相比差異不顯著（P＞0.05）；玉米糖肽的羥自由基清除能力呈逐漸增強的變化趨勢，在連續納濾5 次后， 玉米糖肽的羥自由基清除率從11.25%提高到15.85%，可能是由于納濾操作將玉米糖肽中的鹽分有效脫除，抗氧化活性玉米糖肽的純度增大，進而清除羥自由基的能力增強。 于國才和Bourseau 等的研究也發現納濾脫鹽可以增加脫鹽產物的羥自由基清除能力[11，22]。

由圖5（b）可知，與未納濾脫鹽處理的玉米糖肽相比，經納濾1 次后，玉米糖肽的Fe2＋-螯合率無顯著變化，繼續增加納濾次數，玉米糖肽的Fe2＋-螯合率顯著降低后趨于穩定。 在連續納濾5 次后，玉米糖肽的Fe2＋-螯合率與未納濾脫鹽處理的玉米糖肽相比降低了46.07%， 分析可能有兩方面的原因，一是部分具有螯合亞鐵離子能力的玉米糖肽損失，二是玉米糖肽分子中捕獲亞鐵離子的結構被納濾操作的剪切力所破壞。

圖5 納濾次數對羥自由基清除率和DPPH 自由基清除率以及Fe2+-螯合率的影響Fig. 5 Effect of nanofiltration times on hydroxyl and DPPH radicals scavenging rate as well as Fe2 +-chelating activity

2.4 相對分子質量200 納濾膜脫鹽對玉米糖肽中D-氨基葡萄糖質量分數的影響

在玉米糖肽溶液中存在未反應的游離D-氨基葡萄糖，在實驗室水平上可以采用相對分子質量100～500 的透析膜去除[8]，但此方法處理時間長、處理量小，不適合大規模工業化生產，限制了玉米糖肽的進一步開發與應用。 研究玉米糖肽中D-氨基葡萄糖的質量分數隨納濾次數的變化，以表征納濾脫鹽對玉米糖肽的脫糖效果，結果見6。隨著納濾次數的增加， 玉米糖肽中D-氨基葡萄糖的質量分數逐漸下降，但下降幅度較小，可能是D-氨基葡萄糖的相對分子質量與采用的納濾膜的截留相對分子質量接近導致的。 在納濾次數為5 時，玉米糖肽中D-氨基葡萄糖的質量分數為27.03%， 與納濾前相比降低了37.54%， 與玉米糖肽中D-氨基葡萄糖質量分數為13.92%相比[8]， 說明采用相對分子質量200 納濾膜脫鹽時， 可以將55.54%的游離D-氨基葡萄糖去除。 以上結果說明玉米糖肽溶液通過相對分子質量200 納濾膜，可以起到脫鹽、脫糖和濃縮三重功效，但還需要進一步對脫糖的工藝條件進行研究，以期簡化玉米糖肽的制備工藝。

圖6 納濾次數對玉米糖肽中D-氨基葡萄糖質量分數的影響Fig. 6 Effect of nanofiltration times on D-glucosamine content in zein glycopeptide

3 結語

隨著人民生活水平的提高，對食品健康的重視程度不斷增加，玉米糖肽制備過程中為了維持蛋白酶和TGase 穩定而引入的鹽分會限制其作為保健食品及食品基料在食品工業中的應用。 為了去除玉米糖肽中過多的鹽分，采用相對分子質量200 納濾膜對其進行脫鹽處理，確定了對玉米糖肽抗氧化活性影響較小的納濾脫鹽工藝參數：壓力2.0 MPa、溫度20 ℃、納濾5 次，每次體積濃縮倍數為2。在此條件下， 還可以除去反應體系中55.54%未反應的D-氨基葡萄糖，起到脫鹽、脫糖和濃縮的三重作用。 在此基礎上， 需要進一步對納濾膜脫除未反應D-氨基葡萄糖的工藝條件進行研究，以期簡化玉米糖肽的制備工藝，促進玉米糖肽的工業化生產及應用。