碳酸酐酶Ⅸ蛋白在鼻咽癌組織中的表達及其與預后的關系

吳蕓，張貴

鼻咽癌在我國具有較高發病率，放化療是針對中晚期鼻炎癌治療的主要方法，但術后仍具有較多病人存在轉移和復發的可能性，相關研究提示放化療聯合靶向藥物治療能夠有助于提高病人的生存率并改善生活質量［1］。文獻提示實體腫瘤普遍存在乏氧，進而誘發生成腫瘤血管，促進腫瘤的發生、發展、轉移及浸潤［2］。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）被證實與腫瘤乏氧細胞關系密切，而乏氧能夠抗拒放療，CAⅨ可在多種惡性腫瘤中過度表達，進而影響腫瘤的進展和病人的預后［3］。文獻提示酶聯免疫法檢測鼻咽癌CAⅨ表達水平，發現其與腫瘤的預后具有相關性［4］，但鼻咽癌組織中的CAⅨ水平與腫瘤進展情況是否具有一致性還有待進一步研究證實。故而，本研究利用免疫組化染色法檢測CAⅨ蛋白表達并探討了其在鼻咽癌組織中的表達及與預后的關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013 年1 月至2015 年1 月泰州市人民醫院保存的鼻炎癌組織標本122 例，男77例，女45 例，≤45 歲56 例，＞45 歲66 例。納入標準：（1）均經病理學確診；（2）術前未行放化療等抗腫瘤治療；（3）臨床隨訪資料保存完整。排除標準：（1）合并有其他系統腫瘤；（2）合并有心腦血管疾病、肝腎功能障礙、免疫系統疾病等；（3）妊娠期或哺乳期婦女。同時選取慢性鼻咽炎性組織60 例作為對照組，其中男40例，女20例，≤45歲25例，＞45歲35例。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組病人或其近親屬對所受檢測知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 檢測方法采用免疫組化染色法檢測CAⅨ蛋白表達，取適量鼻咽癌腫瘤組織，常規石蠟切片，脫蠟、水化后利用檸檬酸高壓修復抗原過氧化氫（3%）阻斷內源化過氧化物酶活性，鼠抗人CAⅨ一抗加入后反應過夜（4 ℃），二抗30 min孵育（37 ℃），DAB顯色，蘇木精復染，PBS代替一抗為陰性對照并設立陽性對照［5］。

1.3 結果判斷以細胞膜或胞質出現黃色顆粒為陽性染色。（1）染色強度：無著色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。（2）陽性細胞比例：＜10%為0 分，10%～＜25%為1 分，25%～＜50%為2 分，≥50%為3 分。（1）+（2）得分≥3 分為陽性表達［6］。

1.4 統計學方法使用SPSS 22.0 進行研究資料分析。觀測資料中的計量數據，均通過正態性檢驗，以±s描述。兩組間的比較為成組t檢驗或校正t檢驗。計數資料以例數及率描述，采用χ2檢驗或校正χ2檢驗。 此外，生存等時間隊列資料建立Kaplan-Meier 乘積限生存曲線模型，組間生存率比較為Logrank 檢驗。預后（無進展生存）影響因素的綜合分析為COX 比例風險回歸，采用逐步后退法進行變量的選擇和剔除。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組CAⅨ蛋白表達比較鼻咽癌組CAⅨ蛋白陽性68 例，表達率為55.74%，明顯高于慢性鼻咽炎性組的10（16.67%）例，差異有統計學意義（χ2=25.07，P＜0.05）。

2.2 CA Ⅸ蛋白表達與病人臨床病理特征關系CAⅨ蛋白表達和淋巴結轉移有密切關聯（P＜0.05），與病人年齡、性別、腫瘤長徑、TNM 分期、病理類型和淋巴結轉移無顯著關聯（P＞0.05）。但TNM 分期的P值較小（P=0.056）見表1。

表1 碳酸酐酶Ⅸ（CAⅨ）蛋白表達與病人臨床病理特征關系/例（%）

2.3 CAⅨ蛋白表達與無進展生存資料關系術后所有病人均常規給予同步放化療。CAⅨ蛋白陽性表達組無進展中位生存期為46個月（95%CI：36.7～55.2），明顯低于CAⅨ蛋白陰性表達組的60 個月（95%CI：48.3～72.9），經Logrank 檢驗差異有統計學意義（χ2=5.41，P=0.020），見圖1。

圖1 鼻咽癌組生存曲線圖

2.4 鼻咽癌病人預后（無進展生存）影響因素的COX 回歸分析建立COX 比例風險回歸模型，以本研究資料為樣本，以預后狀況（無進展生存）為應變量，賦值1=有進展或死亡，0=無進展，t=無進展生存期。以CAⅨ蛋白表達及前述單因素分析（表1）中P＜0.10 的指標/因素為自變量。各變量賦值見表2?；貧w過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。 回歸結果顯示：TNM 分期（較高）、淋巴結轉移和CAⅨ蛋白陽性表達是鼻咽癌病人預后（無進展生存）的危險影響因素（HR=2.06、1.65和1.47，P＜0.05）。

表2 鼻咽癌病人預后（無進展生存）影響因素的COX回歸分析結果

3 討論

鼻咽癌致病因素較多，大部分病人確認時已為晚期，因此，能夠在早期進行準確診斷或抑制腫瘤細胞的轉移對提高治療效果和延長病人生存期具有重要臨床意義［7］。血清標志物的檢測是腫瘤診斷的重要方法之一，因靈敏性高、操作簡單方便等優點在臨床應用廣泛。堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶及腫瘤壞死因子均是重要的鼻咽癌血清標志物，但上述多種標志物僅能對鼻咽癌的某一特性進行反映，無法反映鼻咽癌的總體情況［8-9］。

CAⅨ是一類腫瘤相關抗原，亦是碳酸酐酶家族的重要成員，文獻提示CAⅨ與表皮生長因子受體等腫瘤特異性轉移和侵襲性蛋白表達呈正相關［10］。本研究比較鼻咽癌組和慢性鼻咽炎性組CAⅨ蛋白表達發現鼻咽癌組CAⅨ蛋白陽性表達率明顯高于慢性鼻咽炎性組；臨床病理關系結果顯示CAⅨ蛋白表達與病人年齡、性別、腫瘤長徑、TNM 分期、病理類型無明顯關聯關系。上述結果提示CAⅨ蛋白的編導可能與鼻咽癌的病情程度具有相關性。文獻［11-12］提示β-catenin 能與CAⅨ相互作用進而降低細胞黏附作用，而細胞黏附作用的不穩定及喪失與腫瘤的侵襲性關系密切，因此CAⅨ可能是通過介導細胞的黏附作用而促進腫瘤的進展、轉移和復發。

CAⅨ蛋白表達與無進展生存期關系結果顯示CAⅨ蛋白陽性表達組無進展生存期為46 個月明顯低于CAⅨ蛋白陰性表達組的60 個月。上述結果提示鼻咽癌組織CAⅨ蛋白表達異常升高可導致鼻咽癌病人的預后惡化。有研究對頭頸鱗癌病人的CAⅨ表達分析發現，陽性表達病人存在較大的腫瘤壞死范圍，微血管密度和T 分期也有升高或增強現象［13］，進而提示CAⅨ的過表達有利于腫瘤細胞的生存，能夠在某種程度上提高腫瘤細胞抗拒放化療的能力，具有成為頭頸腫瘤治療重要靶點的潛力。相關研究將星形細胞瘤進行檢測發現，近80%的細胞瘤存在CAⅨ陽性表達，該表達水平還與腫瘤分級存在關聯性［14-15］，提示CAⅨ具有成為細胞瘤預后的重要預測因子。

COX 回歸分析研究中將上述病人臨床病理特征、CAⅨ蛋白表達作為自變量，無進展生存期作為因變量進行COX 回歸分析，結果顯示，TNM 分期、淋巴結轉移和CAⅨ蛋白表達是鼻咽癌病人預后（無進展生存）的危險影響因素。上述結果提示鼻咽癌組織CAⅨ蛋白表達是病人預后和病情發展的重要因素。研究證實HIF-1α 能夠促進上皮-間質的轉移和轉化，進而調節腫瘤重要的介質TEIST 的表達而加速腫瘤的轉移，而CAⅨ作為HIF-1α 下游的重要靶基因，其與HIF-1α 的表達呈顯著正相關，因而CAⅨ促進鼻咽癌腫瘤細胞的轉移可能是通過介導HIF-1α 的表達，進而調節鼻咽癌腫瘤敏感轉移介質的表達而影響病人的預后［16-18］。因此，臨床可考慮CAⅨ為研究靶點對鼻咽癌的具體作用機制進行大樣本量的深入分析以確證CAⅨ的具體作用機制，進而為臨床鼻咽癌的早期診斷和預后提供新的思路。