泛素特異性肽酶22、滋養層細胞表面抗原-2表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系及對預后的影響

王在凡，王蕊，李海濤

調查顯示，鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）患病率居耳鼻喉頭頸部惡性腫瘤第1 位，具有易浸潤性、高轉移性、易復發等多種特點［1-2］，但目前臨床尚未完全明確NPC 的病因及發生機制。相關研究指出，Trop2 在人體正常細胞中呈相對低表達狀態，但在結腸癌、肺鱗癌等多種腫瘤組織中呈異常高表達［3］。USP22 作為腫瘤干細胞標志家族中重要成員，具有去泛素化作用，可利用底物靶分子的去泛素化修飾作用，達到調節細胞多種基因轉錄的目的［4］。目前臨床實踐已發現USP22、Trop2 在肺癌、腸癌、胃癌等多種腫瘤中呈高表達狀態［5］。但二者在NPC 中相關研究鮮有報道。鑒于此，本研究以USP22、Trop2 蛋白表達為觀察指標，旨在探討其與NPC 病人臨床病理特征的關系及對預后的影響。具體分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料從2014 年1 月至2016 年6 月于安陽市眼科醫院就診的鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）病人中選取符合后述入排標準的病人92 例及對應的組織標本作為觀察組，其中男70 例，女22 例，年齡（50.95±5.21）歲，范圍為40～68 歲；體質量指數（BMI）（22.84±2.03）kg/m2，范圍為18.5～27.6 kg/m2；其中76 例鱗狀細胞癌，1 例黏液表皮樣癌，7例淋巴上皮瘤樣癌，4例腺癌，2例柱狀細胞癌，2 例腺樣囊性癌；另選取同期通過病理檢驗排除鼻咽癌而被確診為慢性鼻咽炎病人及其組織標本95例作為對照組，其中男72 例，女23 例，年齡（51.27±4.98）歲，范圍為41～69 歲；BMI（23.15±2.14）kg/m2，范圍為18.3～27.8 kg/m2。兩組基本資料（年齡、性別、BMI）均衡可比（t=0.43，P=0.668；χ2=0.00，P=0.962；t=1.02，P=0.311）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 選取標準

1.2.1 納入標準 （1）觀察組均符合以下標準：參照《2016 英國國家多學科指南：鼻咽癌》［6］中NPC 診斷標準，TNM 分期為Ⅰ～Ⅳ期；均經鼻咽活檢病理檢查、顱神經檢查、全細胞計數等證實為NPC；Karnofsky（KPS）評分≥70 分；術前無放化療；（2）對照組均伴有鼻咽干燥不適、黏稠樣分泌物不易咳出等臨床表現，同時經纖維鼻咽鏡、血常規等檢查確診；（3）兩組臨床資料完整，且病人及近親屬知情并簽署承諾書。

1.2.2 排除標準 （1）肝腎等重要臟器器質性病變者；（2）入院前接受放療、化療或其他抗腫瘤治療者；（3）凝血機制紊亂或活動性內出血者；（4）合并其他部位惡性腫瘤者；（5）繼發性或原發性認知功能障礙或精神行為異常者。

1.3 方法

1.3.1 試劑兔抗人USP22 多克隆抗體、兔抗人Trop2 多克隆抗體均購自英國Abcam 公司、即用型快捷免疫組化MaxVision 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、抗原修復液等試劑購自深圳欣海凌生物科技有限公司。

1.3.2 免疫組織化學染色收集觀察組的NPC 組織及對照組的鼻咽黏膜組織，用4%的中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。應用免疫組織化學MaxVision法進行染色，操作嚴格按照說明書執行。具體步驟：常規石蠟切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，枸

櫞酸鹽修復液高壓修復3 min，免疫組化筆在檢測組織外圍（約1～2 mm）處劃圈，3%過氧化氫孵育20 min，封閉內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，加入適量正常羊血清（10%），室溫條件下封閉15 min，棄血清，滴加兔抗人Trop2 多克隆抗體（1∶500 稀釋）或兔抗人USP22 多克隆抗體（1∶200 稀釋）一抗，4 ℃下孵育1 h，PBS 洗滌3 次后加入二抗，室溫孵育15 min。PBS 洗滌3 次，DAB 顯色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。同時以自身對照作為陽性對照，以PBS 代替一抗作陰性對照。

1.3.3 免疫組化結果判定［7］由2 位病理科醫師雙盲條件下使用高倍顯微鏡觀察切片，結果不一致時協商統一判定結果。USP22蛋白著色主要定位于細胞質，Trop2 蛋白著色主要定位于細胞膜和細胞質，根據染色陽性細胞所占同類細胞總數百分比分為四級：0 分為＜1%，1 分為1%～10%；2 分為11%～50%；3 分為＞50%。染色強度根據腫瘤細胞著色深淺計分：0 分為無著色；1 分為黃色為弱陽性；2 分為淺棕色為中等陽性；3 分為棕褐色為強陽性。根據切片中陽性細胞數比例、細胞著色強度評分的乘積進行判定：0 分為陰性，1～2 分為弱陽性，3～4 分為陽性，＞4 分為強陽性，統計學處理時將分級≥1 分歸為陽性。

1.4 觀察指標 （1）對比兩組USP22、Trop2 蛋白表達水平。（2）采用受試者工作特征曲線（ROC）分析USP22、Trop2 診斷價值。（3）對比不同臨床病理特征病人USP22、Trop2 表達陽性率。（4）采用Pearson 線性相關性分析USP22、Trop2蛋白陽性率NPC臨床病理特征關聯性。（5）對比不同USP22、Trop2蛋白表達水平病人3 年生存率。（6）采用Kaplan-Meier（KM）曲線分析生存價值。

1.5 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件分析處理數據。計數資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。此外，采用Logistic回歸進行影響因素分析。采用Pearson 進行線性相關性分析。采用ROC 曲線評估診斷價值。采用KM 曲線進行生存曲線分析，采用Log-Rank 檢驗比較兩組生存率。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組USP22、Trop2 蛋白表達水平觀察組USP22、Trop2 蛋白陽性表達率高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組USP22、Trop2蛋白表達水平比較/例（%）

2.2 USP22、Trop2 診斷價值 USP22、Trop2 聯合診斷的準確性、敏感性均高于二者單一診斷；兩者聯合診斷特異性與單一診斷無明顯差別，見表2。

表2 USP22、Trop2蛋白對NPC診斷價值/%

2.3 不同臨床病理特征病人USP22、Trop2 蛋白陽性表達率不同病理分型、年齡、性別病人USP22、Trop2蛋白陽性表達率差異無統計學意義（P＞0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴結轉移的NPC 病人組織標本中USP22、Trop2 蛋白陽性表達率高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無淋巴結轉移者（P＜0.05），見表3。

2.4 USP22、Trop2蛋白表達的影響因素分析（多因素綜合分析） 建立非條件logistic 回歸模型，以本研究資料為樣本，再分別以USP22、Trop2 蛋白表達情況為應變量，賦值1=陽性表達，0=陰性表達。以上述單因素分析（表3）中P＜0.10 的指標/因素為自變量。各變量賦值見表4。回歸過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05?；貧w結果顯示：TNM分期、淋巴結轉移、分化程度等3 個因素均為USP22、Trop2 蛋白表達的影響因素或關聯因素（P＜0.05）。

表3 不同臨床病理特征病人USP22、Trop2蛋白陽性表達率比較/例（%）

表4 Logistic回歸結果

2.5 USP22、Trop2 蛋白水平與NPC 臨床病理特征關聯性 Pearson 線性相關性分析，USP22、Trop2 蛋白水平與TNM 分期、淋巴結轉移呈正相關，與分化程度呈負相關（P＜0.05），見表5。

表5 USP22、Trop2蛋白水平與NPC臨床病理特征關聯性

2.6 不同USP22、Trop2 蛋白表達水平病人3 年生存率 USP22、Trop2 蛋白陽性表達病人3 年總生存率、無進展生存率低于陰性表達病人，均差異有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 不同USP22、Trop2蛋白表達水平病人3年生存比較/例（%）

2.7 生存分析隨訪3 年，以ROC 曲線最佳截斷值分為低危組、高危組，KM 曲線分析顯示USP22 蛋白、Trop2 蛋白高危組、低危組生存曲線有較明顯的差別。經Logrank 檢驗，兩組生存率差異有統計學意義（χ21=8.95，P1=0.003；χ22=20.57，P2＜0.001）。

3 討論

研究發現，由于NPC 發病部位多位于鼻咽部較深位置，確診時已有60%～70%病人出現局部進展［8］，嚴重降低NPC 病人生存率?，F階段臨床尚未完全明確NPC 致病及其進展的分子機制，臨床實踐表明，NPC 分子致病機制多認為與主要原癌基因、抑癌基因的異常表達與改變及Akt 信號通路、絲裂原蛋白激酶通路、Wnt 信號通路的改變等有關［9］。因此，深入研究NPC 分子機制，對提高NPC 病人生存率具有積極作用。

USP22 是細胞信號網絡中的樞紐分子，可通過去除泛素連接蛋白底物上的泛素，控制泛素化過程，降解細胞內多種蛋白，調節抗原呈遞、腫瘤形成、信號轉導、轉錄調控等一系列細胞內活動［10］。莫文法等［11］采用免疫組化法檢測60例NPC組織、20例鼻咽黏膜慢性炎組織發現，USP22 蛋白陽性表達率在NPC 病人中呈高表達狀態，支持本研究觀點。充分表明USP22 蛋白在NPC 腫瘤細胞的生長過程中發揮致癌因子作用，USP22 蛋白陽性表達率升高可激活c-Myc 轉錄，下調AKT/GSK-3/Cyclin 通路中的p-AKT、p-GSK-3β、cy-clinD1 表達，影響細胞增殖周期，同時通過去泛素化端粒重復序列連接因子1（TRF1），一定程度可干擾TRF1穩定性，參與端粒維持，從而促進腫瘤細胞增殖、生長、侵襲［12］，另外通過刺激局部黏著斑酶信號通路、去泛素化上皮間質轉化因子通路，能加快上皮間質轉化進程，導致惡性腫瘤侵襲、癌細胞轉移。此外，經logistic 回歸及Pearson 線性相關性分析可知，USP22 蛋白水平與TNM 分期、淋巴結轉移、分化程度存在有密切關聯，與羅錚錚［13］研究一致，說明USP22 具有促進NPC 細胞增殖、提高局部浸潤擴散能力的作用，有望成為評估NPC惡性程度、浸潤侵襲的重要指標。

最后，對比不同USP22 蛋白表達水平病人3 年生存率可知，USP22 蛋白陽性表達病人3 年總生存率、無進展生存率明顯低于陰性表達病人，進一步證實USP22 蛋白有望成為預測NPC 預后的腫瘤標志物及生物治療靶點。

Trop2 可通過激活MAPK/ERK 激酶通路，誘導細胞增殖、遷移、分化及凋亡，參與腫瘤的發生、發展［14-15］。本研究對比兩組Trop2蛋白表達水平發現，NPC 組織標本中Trop2 蛋白陽性表達率明顯高于慢性鼻咽炎組織標本，與李贊華［16］觀點相似，說明Trop2 蛋白具有致癌功能。袁廣全［17］研究也證實，Trop2 能激活ERK/MAPK 信號通路，提高細胞周期蛋白D1、cyclinE的表達，調節細胞周期進程，同時隨NPC 發生發展，Trop2 蛋白表達增強，可降低細胞黏附能力，引發細胞連接紊亂，導致癌細胞從原發灶脫落，從而促進細胞致癌性轉化，加快腫瘤血管形成，增強鼻咽癌侵襲、轉移行為，抑制NPC 細胞凋亡。另外，本研究應用ROC 曲線對Trop2 蛋白診斷NPC 價值進行評估，結果發現，Trop2 蛋白診斷NPC準確性（75.40%）＞USP22 蛋白（73.80%），但二者診斷敏感性均＜67.00%，故建議臨床加強Trop2、USP22蛋白表達水平聯合檢測，以便及早檢出NPC 高危人群，抑制病情進展。此外，分析Trop2 蛋白表達與NPC臨床病理特征關系得出，Trop2蛋白表達水平在TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴結轉移的NPC 組織中呈異常高表達狀況，與陳順金等［18］研究相符，提示Trop2 蛋白可能與NPC 病人預后存在密切聯系。進一步經Log-Rank 檢驗得知，Trop2 蛋白陽性高表達水平會增加NPC 病人死亡風險，充分說明Trop2 蛋白可作為預測NPC 病人預后的潛在有效指標。

綜上可知，Trop2、USP22 蛋白表達水平在NPC病人中呈異常高表達狀態，與TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移存在一定關聯性，加強Trop2、USP22 蛋白表達水平聯合檢測，對早期識別NPC、評估預后具有重要指導意義。