長鏈非編碼RNA HULC在乳腺癌組織中表達及臨床意義

袁小筍，張蕾，馬慧利，薛永飛，李長生，張敬偉，任中海，張騰飛

乳腺癌作為女性高發惡性腫瘤，盡管病人早期發現率不斷提高，且診療手段的不斷進步，但病人遠期預后仍然改善有限［1］，轉移和復發仍是導致病人死亡的主要因素［2］。因此，深入探討與乳腺癌轉移相關的機制或敏感基因對指導病人臨床診療及改善預后意義重大。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一種長度在200 nt以上且缺乏編譯蛋白功能的RNA，以往被認為是一種“垃圾基因”，隨著研究深入，其在表觀遺傳修飾及基因轉錄和翻譯中的調控作用越來越受到重視［3］，已被發現參與了多種疾病發生過程［4］，同時與腫瘤生長、侵襲轉移等密切相關［5］，肝癌高表達轉錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）是最早在肝癌中發現的一種lncRNA［6］，近年來發現其在胰腺癌［7］、淋巴瘤［8］等多種惡性腫瘤組織中表達異常，但其在乳腺癌組織表達如何鮮有報道。本研究分析乳腺癌組織中HULC 表達，探討其在不同臨床病理指標間表達差異性，以及與預后的相關性，以期為乳腺癌機制研究及臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013 年5 月至2015 年5 月在南陽市中心醫院乳腺科行手術治療且資料完整的乳腺癌病人112例，入選病人均為女性，術前未接受放化療，術后病理學檢查證實。年齡（56.58±11.52）歲，范圍為26～75 歲。病理學類型：浸潤性導管癌88 例，其他類型24 例；腫瘤直徑：＞2 cm 62 例，≤2 cm 50 例；組織學分級：Ⅰ級31 例，Ⅱ級46 例，Ⅲ級35例；按照第七版TNM 分期標準：Ⅰ期24 例，Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期36 例；發生腋窩淋巴結轉移41 例，根

據雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體2（HER-2）和Ki-67 檢查結果進行分子分型：Luminal A 型33 例，Luminal B 型29 例，HER-2過表達型21 例，三陰性（TNBC）型29 例。所有病人于手術中留取乳腺癌及距離腫瘤邊緣＞5 cm 正常乳腺組織，快速置于液氮中，-80 ℃保存。病人或其近親屬均行知情同意。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 術檢測乳腺癌和正常乳腺組織中HULC 表達取組織，剪碎、研磨，加入細胞裂解液，按總RNA 提取試劑盒（Trizol 法，購自上海百研生物科技有限公司）說明提取總RNA，并利用逆轉錄試劑盒（購自美國Thermo 公司）獲得cDNA，使用美國ABI 公司生產的7500 熒光定量PCR儀按SYBR green RT-PCR 反應試劑盒（購自美國Thermo 公司）擴增引物。引物序列：HULC：正向引物為5’-ACTCTGAAGTAAAGGCCGGA-3’，反向引物為5’-TGCCAGGAAACTTCTTGCTTG-3’，GAPDH：正向引物為5’-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3’，反向引物為5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。反應條件：95 ℃2 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，連續38 次循環。用2-ΔΔCt法計算HULC 表達量。

1.2.2 病例隨訪 112 例病人均于術后1 天開始隨訪，中途無失訪，隨訪形式包括住院期間查房、出院后門診復查、病歷追蹤等，隨訪截止日期2020 年5月31 日，所有病人隨訪滿5 年，以死亡作為終點事件，記錄病人生存時間。

1.3 統計學方法使用SPSS 21.0 軟件分析，計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，采用Cox 比例風險回歸模型分析影響乳腺癌病人預后的風險因素。

2 結果

2.1 乳腺癌和正常乳腺組織中HULC 表達乳腺癌組織中HULC 表達量為（2.27±0.18），高于正常乳腺組織的（1.02±0.08），差異有統計意義（t=67.38，P＜0.001）。

2.2 不同臨床病理指標的乳腺癌組織中HULC 表達不同年齡、病理學類型、腫瘤直徑、是否絕經、分子分型、PR 和HER-2 的乳腺癌組織中HULC 表達量差異無統計學意義（P＞0.05），不同組織學分級、TNM 分期、淋巴結轉移、ER 和Ki-67 的乳腺癌組織中HULC 表達量差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同臨床病理指標的乳腺癌組織中HULC表達/±s

表1 不同臨床病理指標的乳腺癌組織中HULC表達/±s

注：ER為雌激素受體，PR為孕激素受體，HER-2為人類表皮生長因子受體2。

指標年齡≥57歲＜57歲病理學類型浸潤性導管癌其他類型腫瘤長徑＞2 cm≤2 cm絕經是否組織學分級Ⅰ～Ⅱ級Ⅲ級TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結轉移是否分子分型Luminal A型Luminal B型HER-2過表達型TNBC型ER陽性陰性PR陽性陰性HER-2陽性陰性Ki-67≥20%＜20%例數66 46 88 24 62 50 67 45 77 35 76 36 41 71 33 29 21 29 67 45 43 69 65 47 67 45 HULC表達量2.26±0.18 2.29±0.19 2.29±0.18 2.23±0.16 2.28±0.17 2.26±0.19 2.25±0.17 2.30±0.19 2.24±0.17 2.34±0.18 2.23±0.16 2.36±0.19 2.36±0.18 2.22±0.16 2.27±0.17 2.26±0.18 2.22±0.15 2.32±0.21 2.31±0.16 2.22±0.20 2.31±0.17 2.25±0.18 2.29±0.17 2.25±0.19 2.24±0.17 2.32±0.18 t值0.73 1.50 0.51 1.45 2.70 3.51 4.16 1.13 2.56 1.55 1.38 2.44 P值0.466 0.135 0.609 0.149 0.008 0.001＜0.001 0.342 0.012 0.124 0.169 0.016

2.3 乳腺癌組織中HULC 表達對生存時間的影響 112例病人隨訪時間2～60個月，中位隨訪時間44 個月。以乳腺癌組織中HULC 表達量的P25值為界值［9］，將病人分為低表達組（n=29）和高表達組（n=83），生存分析結果顯示，低表達組病人平均生存時間（52.72±3.06）個月，5 年生存率為82.76%，高表達組病人則分別為（35.51±2.25）個月和36.14%，Log-Rank檢驗差異有統計學意義（χ2=15.16，P＜0.001）。

2.4 乳腺癌病人預后影響因素分析 Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，HULC 表達是影響乳腺癌病人預后的獨立風險因素［HR=5.249（95%CI：1.965～14.024），P＜0.05］，見表2。

表2 乳腺癌病人預后影響因素的Cox比例風險回歸模型分析

3 討論

乳腺癌作為威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一，發病率呈逐年升高趨勢且發病年齡年輕化［10］，雖然現有的綜合性及個體化治療手段不斷進步，但乳腺癌細胞易轉移，特別是發生腦、肺、骨等遠處轉移仍是導致病人治療失敗及死亡的主要影響因素［11］。但目前，有關乳腺癌轉移的相關機制及作用基因尚未完全研究清楚。有研究指出，lncRNA 表達失調參與了惡性腫瘤侵襲轉移過程［12］。且乳腺癌病人存在lncRNA 表達異常［13-14］。HULC 作為一種位于人染色體6p24.3 上的lncRNA，主要位于細胞質，可通過結合核糖體而在多種生理病理過程中發揮重要作用［15］。有研究指出［16］，HULC 在HBV 相關肝癌表達量升高，可作為早期診斷潛在標志。葉華等［17］指出，HULC 參與了膽管細胞癌的發生和發展。王鵬等［18］則指出，HULC 調控肺腺癌細胞的增殖和侵襲。本研究結果顯示，乳腺癌組織中HULC 表達量高于正常乳腺組織，說明HULC 在乳腺癌組織中呈高表達。且進一步分析發現，組織學分級Ⅲ級、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、發生淋巴結轉移的乳腺癌組織中HULC 表達量升高，說明HULC 表達與乳腺癌惡性進程指標有關，可能參與了乳腺癌惡性進行，同時，本研究顯示，ER 陽性和Ki-67＜20%的腺癌組織中HULC 表達量升高，進一步說明HULC 可能通過調控ER 活化劑參與細胞增殖而在乳腺癌進程中發揮作用，但具體作用機制有待開展相關研究予以明確。

Ding等［19］通過對各種癌癥病人HULC 的預后價值進行薈萃分析和系統評價發現，lncRNA HULC 可作為癌癥預后和轉移的新分子標記。本研究Kaplan-Meier 分析結果顯示，HULC 低表達組病人平均生存時間和5 年生存率均高于高表達組，說明乳腺癌病人組織中HULC 高表達可能與其不良預后有關。行Cox比例風險回歸模型分析發現，HULC表達是影響乳腺癌病人預后的風險因素，進一步說明HULC 表達可能是影響病人預后的因素，可能是評估病人預后的潛在標志物。

綜上所述，乳腺癌組織中HULC 表達量升高，可能發揮類似癌基因的作用而參與了乳腺癌進展，且是影響病人預后的風險因素，有望成為評估病人預后的潛在標志物。