微小RNA-204-5p靶向蛋白質酪氨酸磷酸酶1B基因對缺氧復氧誘導的大鼠心肌細胞氧化應激的影響

李瓊，王磊，高波

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由冠狀動脈急性持續缺血缺氧引起心肌壞死的心血管疾病，具有極高的致死率。目前，臨床主要采用溶栓、經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈搭橋手術等手段恢復心肌血液供應。然而，一旦心肌供血恢復，會引起心肌細胞氧化應激，導致細胞損傷和凋亡［1］。近年來，越來越多的數據表明，微小RNA（microRNA，miRNA）的表達失調與人類多種心血管疾病有關［2］，包括缺氧復氧損傷［3］。miR-204-5p位于人類染色體9q21.12，Xiao 等［4］研究發現，缺氧復氧誘導下心肌細胞中miR-204-5p 表達下調，miR-204-5p 通過靶向自噬相關蛋白LC3-Ⅱ調控缺氧復氧誘導的心肌細胞自噬；此外，Qiu 等［5］研究表明，miR-204-5p 通過調節沉默調節蛋白1（Silencing regulatory protein 1，sirt1）介導的自噬，保護H9C2 細胞免受缺氧復氧誘導的損傷。然而，miR-204-5p 對缺氧復氧誘導下的心肌細胞氧化應激的影響和機制仍有待闡明。本研究以心肌細胞缺氧復氧模型模擬AMI 過程，旨在闡明miR-204-5p 對缺氧復氧誘導下的心肌細胞氧化應激和凋亡的影響，探索其分子機制，以期為臨床治療AMI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料大鼠胚胎心肌細胞株H9C2購于上海中科院典型培養物保藏細胞庫；MTT 試劑盒購于美國Sigma 公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自美國Promega 公司；乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白（cTnT）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒南京建成生物工程研究所；PCR 引物、miR-con、miR-204-5p mimics、pcDNA、pcDNA-蛋白質酪氨酸磷酸酶1B（The protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）及WT-PTP1B 和MUT-PTP1B 的構建和測序均由上海生工公司提供。膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；Trizol 試劑和western 相關試劑購于上海碧云天公司；細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl相關X（Bax）等鼠源Ⅰ抗購于美國Santa Cruz公司；兔源PTP1B抗體購于Abcam公司；HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購于武漢博士德公司；LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 H9C2 心肌細胞缺氧復氧模型的建立用高糖DMEM 培養基（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液）在37 ℃含5%二氧化碳的細胞培養箱中培養H9C2。將H9C2 細胞培養基更換為無糖DMEM培養基，置于缺氧培養箱中培養6 h，復氧時更換為新鮮高糖DMEM 培養基常規培養6 h，標記為缺氧復氧組；未經任何處理的H9c2細胞標記為空白組。

1.2.2 細胞轉染和實驗分組收集對數期的H9c2細胞，分別將miR-con、miR-204-5p mimics 轉染至H9c2細胞，轉染成功后按照“1.2.1”方法進行缺氧復氧處理，分別標記為缺氧復氧+miR-con 組、缺氧復氧+miR-204-5p 組。后續實驗中為進一步驗證miR-204-5p 是通過調控PTP1B 表達進而影響缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激，將miR-204-5p mimics 和pcDNA 共轉染至H9c2 細胞，進行缺氧復氧處理后標記為缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA 組；將miR-204-5p mimics 和pcDNA-PTP1B 共轉染至H9c2 細胞，進行缺氧復氧處理后標記為缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B 組。轉染方法參照LipofectamineTM2000使用說明書。

1.2.3 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRTPCR）檢測用Trizol 法提取H9C2 細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板制備qRT-PCR反應體系，上實時熒光定量PCR 儀檢測miR-204-5p 和PTP1B mRNA的相對表達量。

1.2.4 熒光素酶報告基因實驗 TargetScan 預測發現miR-204-5p 與PTP1B 序列的3’-UTR 存在結合位點。將含有結合位點的PTP1B3’-UTR 片段或cDNA插入熒光素酶報告基因載體構建WT-PTP1B、MUTPTP1B。分別將WT-PTP1B、MUT-PTP1B 與miR-204-5p mimics 共轉染至H9c2 細胞，收集轉染48 h細胞并測定各組細胞中熒光素酶活性。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色（MTT）法檢測細胞增殖收集各組對數生長期H9c2細胞，細胞接種至96 孔板，每孔加入10μL 的MTT 試劑（5 g/L）孵育4 h，棄上清，向各孔內加入150μL的DMSO，振蕩10 min，利用酶標儀檢測各孔490 nm 處吸光度值（OD），細胞存活率（%）=（處理組OD/對照組OD）×100%。

1.2.6 檢測LDH、cTnT、SOD、MDA、ROS 水平細胞分組處理后，收集細胞培養液，按試劑盒操作說明檢測LDH、cTnT含量。同時收集各組H9C2細胞，加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，低溫下12 000 r/min 轉速離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測SOD、MDA、ROS水平。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡用1×binding buffer 重懸各組細胞調整其濃度為1×105個/毫升。取5μL的Annexin V/FITC 和10μL的PI溶液依次加入到100 μL 細胞懸液中，避光孵育15 min，補加1×binding buffer至500μL后，于1 h內上機檢測。

1.2.8 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測 RIPA裂解液提取細胞總蛋白，每組取30 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，經濕法轉膜、脫脂奶粉封閉后，加入各蛋白Ⅰ抗（1∶500 稀釋）及內參β-actin 一抗（1∶1 000 稀釋），洗膜后，加入Ⅱ抗（1∶2 000），化學發光顯影，放入自動凝膠成像系統拍照，Image J 軟件測定各蛋白條帶相對灰度值。

1.3 統計學方法用SPSS 19.0 進行統計學分析，所有數據均用±s表示。兩組數據的比較采用t檢驗；多組數據采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧復氧處理后心肌細胞中miR-204-5p 和PTP1B 表達情況與空白組比較，缺氧復氧組心肌細胞miR-204-5p 表達降低，PTP1BmRNA 和PTP1B蛋白的表達升高（P＜0.05），見表1和圖1。

表1 缺氧復氧處理心肌細胞影響miR-204-5p和PTP1B表達/±s

表1 缺氧復氧處理心肌細胞影響miR-204-5p和PTP1B表達/±s

注：①與空白組向比較，P＜0.05。

組別空白組缺氧復氧組t值P值重復次數99 miR-204-5p 1.00±0.09 0.21±0.04①24.06＜0.001 PTP1B mRNA 1.00±0.13 6.74±0.58①28.97＜0.001 PTP1B蛋白0.31±0.05 0.76±0.08①14.31＜0.001

圖1 檢測心肌細胞中PTP1B蛋白表達

2.2 miR-204-5p 靶向調控PTP1B 的表達 Targetscan 預測到miR-204-5p 與PTP1B 序列的3’UTR存在部分連續結合位點，見圖2A。當上調miR-204-5p 表達后，轉染WT-PTP1B 的3’UTR 報告基因心肌細胞的熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），而轉染MUT-PTP1B 的3’UTR 報告基因心肌細胞的熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見表2。當上調miR-204-5p 表達后，心肌細胞中PTP1B 蛋白的表達顯著降低；當下調miR-204-5p 表達后，心肌細胞中PTP1B 蛋白的表達顯著增加（P＜0.05），見表3 和圖2B。提示PTP1B 是miR-204-5p 的靶基因，miR-204-5p可負性調控PTP1B的表達。

表2 雙熒光素酶報告實驗/±s

表2 雙熒光素酶報告實驗/±s

組別miR-con組miR-204-5p組t值P值重復次數99 WT-PTP1B 1.00±0.09 0.35±0.05 18.94＜0.001 MUT-PTP1B 1.46±0.12 1.52±0.15 0.94 0.363

表3 miR-204-5p靶向PTP1B調控其表達/±s

表3 miR-204-5p靶向PTP1B調控其表達/±s

注：①與miR-con組比較，P＜0.05。②與anti-miR-con組比較，P＜0.05。

組別miR-con組miR-204-5p組anti-miR-con組anti-miR-204-5p組F值P值重復次數9999 PTP1B蛋白0.31±0.04 0.06±0.03①0.29±0.05 0.45±0.06②109.22＜0.001

圖2 miR-204-5p靶向調控PTP1B的表達：A為PTP1B的3’UTR中含有與miR-204-5p互補的核苷酸序列；B為心肌細胞中PTP1B蛋白的表達

2.3 過表達PTP1B逆轉miR-204-5p對缺氧復氧處理誘導的心肌細胞增殖的影響與空白組相比，缺氧復氧處理顯著抑制心肌細胞的存活，促進PTP1B表達，抑制Cyclin D1 表達，促進LDH 和cTnT 的釋

放；與缺氧復氧+miR-con 組相比，缺氧復氧+miR-204-5p 組心肌細胞存活率顯著升高，PTP1B 表達含量顯著降低，Cyclin D1 表達顯著升高；與缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA 組比較，缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B 組心肌細胞存活率顯著降低，PTP1B表達和LDH 含量顯著升高，Cyclin D1 表達顯著降低，LDH 和cTnT 含量顯著升高（P＜0.05），見表4 和圖3。以上結果表明，缺氧復氧處理可顯著抑制心肌細胞存活，而miR-204-5p 通過下調PTP1B 表達促進心肌細胞存活。

圖3 檢測心肌細胞中Cyclin D1蛋白表達

表4 轉染miR-204-5p促進缺氧復氧處理心肌細胞存活率/±s

表4 轉染miR-204-5p促進缺氧復氧處理心肌細胞存活率/±s

注：①與空白組向比較，P＜0.05。②與缺氧復氧+miR-con組向比較，P＜0.05。③與缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA組向比較，P＜0.05。

組別空白組缺氧復氧組缺氧復氧+miR-con組缺氧復氧+miR-204-5p組缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA組缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B組F值P值重復次數999999 PTP1B 0.27±0.07 0.81±0.05①0.78±0.04 0.42±0.18②0.46±0.18 0.61±0.18③23.09＜0.001 Cyclin D1 0.75±0.06 0.34±0.03①0.31±0.04 0.56±0.06②0.61±0.05 0.38±0.04③120.43＜0.001 LDH/（U/L）480.76±36.96 895.91±51.84①850.83±62.11 629.63±54.59②657.84±56.76 721.85±55.49③72.98＜0.001 cTnT/（μg/L）0.26±0.04 0.73±0.08①0.75±0.09 0.42±0.05②0.44±0.06 0.63±0.08③72.16＜0.001細胞存活/%100.00±6.80 55.99±4.69①52.72±4.59 78.37±6.48②78.89±5.74 61.23±6.28③85.49＜0.001

2.4 過表達PTP1B逆轉miR-204-5p對缺氧復氧處理誘導的心肌細胞氧化應激的影響與空白組比較，缺氧復氧處理后心肌細胞ROS 水平顯著提高，SOD 活力顯著降低，MDA 含量顯著升高；與缺氧復氧+miR-con 組比較，缺氧復氧+miR-204-5p 組心肌細胞SOD 活力顯著升高，ROS 水平顯著降低，MDA含量顯著降低；與缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA 組比較，缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B 組心肌細胞SOD 活力降低，ROS 水平顯著提高，MDA 含量升高（P＜0.05），見表5。結果表明，缺氧復氧可誘導心肌細胞氧化損傷，miR-204-5p 通過下調PTP1B 表達則提高抗氧化物酶SOD的活力，降低MDA含量和細胞內ROS水平，對心肌細胞具有保護作用。

表5 過表達PTP1B逆轉miR-204-5p對缺氧復氧處理誘導的心肌細胞氧化應激的影響/±s

表5 過表達PTP1B逆轉miR-204-5p對缺氧復氧處理誘導的心肌細胞氧化應激的影響/±s

注：①與空白組向比較，P＜0.05。②與缺氧復氧+miR-con組向比較，P＜0.05。③與缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA組向比較，P＜0.05。

組別空白組缺氧復氧組缺氧復氧+miR-con組缺氧復氧+miR-204-5p組缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA組缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B組F值P值重復次數9 99999 SOD/（U/L）24.60±1.34 9.85±0.87①10.61±0.95 16.39±0.78②17.46±1.27 12.53±0.86③255.35＜0.001 ROS熒光強度486.53±75.69 1486.24±162.087①1557.26±156.86 789.57±93.62②726.75±86.45 1236.27±126.58③118.14＜0.001 MDA/（nmol/mL）4.83±0.35 15.73±1.18①15.35±1.78 7.84±0.85②8.13±1.09 12.21±1.32③127.54＜0.001

2.5 過表達PTP1B逆轉miR-204-5p對缺氧復氧處理誘導的心肌細胞凋亡的影響與空白組比較，缺氧復氧處理顯著抑制心肌細胞Bcl-2蛋白表達，促進Bax 蛋白表達，促進心肌細胞凋亡；與缺氧復氧+miR-con 組比較，缺氧復氧+miR-204-5p 組心肌細胞Bcl-2蛋白表達顯著升高，Bax蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率降低；與缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA 組比較，缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B 組心肌細胞Bcl-2 蛋白表達顯著降低，Bax 蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率升高（P＜0.05），見表6 和圖4。以上結果表明，缺氧復氧處理可誘導心肌細胞凋亡，而miR-204-5p 通過下調PTP1B 表達可抑制缺氧復氧處理誘導的心肌細胞凋亡。

表6 轉染miR-204-5p抑制缺氧復氧處理心肌細胞凋亡/±s

表6 轉染miR-204-5p抑制缺氧復氧處理心肌細胞凋亡/±s

注：①與空白組向比較，P＜0.05。②與缺氧復氧+miR-con組向比較，P＜0.05。③與缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA組向比較，P＜0.05。

組別空白組缺氧復氧組缺氧復氧+miR-con組缺氧復氧+miR-204-5p組缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA組缺氧復氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B組F值P值重復次數9 99999 Bcl-2蛋白0.67±0.05 0.14±0.03①0.18±0.03 0.45±0.05②0.40±0.04 0.22±0.03③237.52＜0.001 Bax蛋白0.21±0.04 0.85±0.06①0.89±0.07 0.34±0.03②0.41±0.04 0.57±0.06③256.77＜0.001細胞凋亡率/%5.57±0.72 23.26±1.82①22.81±1.44 13.66±1.35②12.59±0.96 18.38±1.16③249.22＜0.001

圖4 檢測心肌細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達

3 討論

AMI是臨床最常見的心血管疾病之一。心肌細胞損傷發生在缺血再灌注損傷后的心肌組織中，氧化應激是心肌缺血再灌注損傷時心肌損傷擴大的重要因素，在急性心肌梗死中起重要作用［6］。

近年來，miRNA 在心血管疾病中的作用引起研究者的興趣，包括miR-223-3p［7］和miR-210［8］在內的許多miRNA 參與心肌細胞氧化應激損傷和凋亡。此外，Li 等［9］研究發現miR-340-5p 通過調節Act1/NF-κB通路對缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激具有保護作用。目前，對miR-204-5p 的研究主要集中在腫瘤領域，其在心血管疾病中的作用并完全闡明。Koyama 等［10］研究發現，miR-204-5p 是醛固酮刺激心肌細胞中t 型鈣通道表達的必需基因；Yu等［11］研究表明，敲減lncRNA AK139328 通過調控miR-204-3p 表達，抑制心肌細胞自噬，可減輕糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷；此外，miR-204通過靶向LC3-Ⅱ對缺血再灌注誘導的心肌細胞自噬具有抑制作用［4］。PTP1B 是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一，廣泛存在于心臟組織中，與心血管疾病密切相關［12］。PTP1B的缺失通過調節細胞自噬可消除內質網應激引起的心肌功能障礙［13］。PTP1B還是循環ADP 核糖體誘導心室肌細胞鈣離子信號轉導的調節因子［14］。此外，miR-135a 通過靶向PTP1B 對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用［15］。生物信息學分析顯示，PTP1B 是miR-204-5p 潛在靶基因，但miR-204-5p 能否介導PTP1B 表達調控缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激尚未可知。

本研究首先檢測了缺氧復氧處理的心肌細胞中miR-204-5p 和PTP1B 的表達，結果顯示，缺氧復氧處理可抑制miR-204-5p 表達，促進PTP1B 表達。進一步研究證實miR-204-5p 可靶向負性調控PTP1B 的表達，于是推測miR-204-5p 通過下調PTP1B參與對缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激的調控。當心肌損傷發生時，LDH和cTnT釋放將明顯增加，通過檢測細胞培養液LDH 和cTnT 的滲漏率能夠有效反映細胞損傷程度［16］。ROS 是引起氧化應激的主要因子，氧化應激引起細胞損傷，導致終產物MDA 的累積［17］。MDA 含量可以反映氧自由基攻擊引起的細胞膜損傷的嚴重程度［18］。研究人員發現，在缺氧復氧誘導的心肌損傷中ROS和MDA的水平升高，超氧化物歧化酶SOD 活性降低［19］。本研究中，缺氧復氧誘導后，心肌細胞存活率降低，細胞上清液中LDH 和cTnT 含量顯著升高，細胞內MDA和ROS 水平顯著升高，而超氧化物歧化酶SOD 水平顯著降低，細胞凋亡率增加；而上調miR-204-5p 可以促進心肌細胞存活，抑制LDH 和cTnT 的釋放，抑制細胞內MDA 和ROS 水平，增加SOD 水平，抑制缺氧復氧誘導的細胞凋亡。此外，我們發現過表達PTP1B 可部分逆轉miR-204-5p 對心肌細胞氧化應激和凋亡的影響。這些結果表明，miR-204-5p 通過靶向PTP1B 表達能夠保護心肌細胞免受缺氧復氧誘導的細胞凋亡和氧化應激。