內皮細胞特異性分子1和血管內皮細胞生長因子在宮頸鱗癌中的表達及其與上皮-間質轉化的相關性

馮磊，楊建敏，楊然，孫麗，董莉麗，張清偉

宮頸癌是全球女性常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率位列女性惡性腫瘤中第二位，主要分為鱗狀細胞癌和腺癌［1］。近年隨著我國醫療技術水平有的提高，早期行手術或者放療，宮頸癌的治療效果得到明顯改善，但女性宮頸癌發病病人卻逐漸年輕化，發病率也呈增高趨勢［2-3］。阻斷腫瘤的發生、發展、轉移以及血管的生成等在其治療過程中起著重要的作用，當前宮頸癌治療所面臨的最大難題是腫瘤細胞的侵襲和轉移，其中上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在發揮著重要作用［4］。內皮細胞特異性分子1（endothelial cell specific molecule-1，ESM-1）是一種新型內皮細胞特異性分子，具有調節血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的功能，研究表明其與腫瘤的發生發展過程中轉移、浸潤與腫瘤新生血管密切相關［5-6］。故而，探索ESM-1、VEGF 與宮頸鱗癌發生EMT 的關系，為宮頸癌靶向治療提供新的指導與靶點，有助于治療方案的制定和預后判定。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018 年12 月至2019 年12 月在南陽市中心醫院接受宮頸癌根治術的宮頸鱗癌病人180 例作為研究組，年齡（41.3±5.7）歲，范圍為24～63 歲。術后石蠟組織標本，所有宮頸鱗癌病例均經過病理科兩名醫師閱片后共同診斷。根據宮頸癌FIGO 分期標準進標準分期［7］，其中Ⅰa 期94例，IIa 期86 例；病理組織學分化：低分化61 例，中分化86 例，高分化33 例；肌層浸潤＜1/2 宮頸83 例，肌層浸潤≥1/2 宮頸97 例；行磁共振成像（MRI）檢查示無淋巴結轉移130例，有淋巴結轉移50例。

另外收集同期南陽市中心醫院源于子宮肌瘤切除術的正常宮頸組織石蠟組織標本60 例作為正常組，臨床資料完整，年齡（42.5±6.1）歲，范圍為21～65 歲。兩組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究參與者均簽署知情同意書。

研究組納入標準：（1）術前均未進行化療、放療或其他輔助治療；（2）切片均HE 染色，經至少兩位病理醫師獨立診斷為子宮頸鱗癌；（3）不伴有其他惡性腫瘤病史；（4）臨床資料完整。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 主要試劑兔抗人E-Cadherin（31955）和Vimentin（5741S）克隆抗體均由美國CST公司提供；兔抗人ESM-1（ATA28878）和VEGF 克隆抗體由武漢益普生物科技有限公司公司提供；兔抗人VEGF（AF0011）克隆抗體由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供；SP 免疫組化試劑盒（IH0975R）由上海雅吉生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標本免疫組化檢測所有宮頸組織經甲醛固定后包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。石蠟切片厚度為5μm，高溫烘烤脫水，3%過氧化氫處理后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，高壓法熱修復，PBS沖洗，山羊血清封閉，加入一抗ESM-1 抗體（1∶100）、VEGF 抗體（1∶100）、E-Cadherin 抗體（1∶100），Vimentin 抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜，PBS 洗脫，加入二抗37 ℃孵育，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，透明處理，中性樹膠封片，以PBS代替一抗作為陰性對照，進行鏡檢判定結果。ESM-1 主要表達于細胞質中，呈棕黃色；VEGF 主要表達于細胞質和細胞膜，呈棕黃色；E-Cadherin 則主要表達于胞膜及胞質中，呈棕黃色或棕褐色；Vimentin 主要表達于細胞質中，呈棕黃色。

1.3.2 結果判定［8］每張切片隨機選取3 個有代表性的高倍視野，ESM-1、VEGF、E-Cadherin 評分采用染色強度及陽性細胞數百分比綜合評價，Vimentin評分采用染色強度直接評分。染色強度評分：無染色為0分，輕度黃染為1分，中度黃染為2分，重度黃染為3 分。陽性細胞數百分比：計數每個組織的3個10×10 倍視野下腫瘤細胞的陽性細胞數，陽性細胞數百分比=（陽性表達的腫瘤細胞數/所有腫瘤細胞數）×100%；評分：＜10%為0 分，10%～24%為1分，25%～49%為2 分，50%～74%為3 分，75%～100%為4 分。ESM-1 結果判定：兩者分值的乘積為最終結果，評分0～3 分為陰性，4～12 分為陽性。VEGF 結果判定：兩者分值的和為最終結果，評分0 分為陰性，1～7 分為陽性。E-Cadherin 結果判定：兩者分值的乘積為最終結果，評分0～4 分為陰性，6～12 分為陽性。Vimentin 結果判定：染色強度直接評分為最終結果，評分0～1 分為陰性，2～3 分為陽性。每張切片的結果判斷均由兩名高年資病理科醫生核準。

1.3.3 比較分析比較正常宮頸和宮頸鱗癌組織中ESM-1、VEGF、E-Cadherin和Vimentin的陽性表達情況。比較其在宮頸鱗癌臨床病理特征的陽性表達情況，宮頸鱗癌臨床病理特征：根據宮頸癌FIGO分期標準進標準分期分為Ⅰa 期和Ⅱa 期；病理組織學分化程度分為低分化，中分化，高分化；宮頸鱗狀細胞癌宮頸浸潤深度分為肌層浸潤＜1/2 宮頸，肌層浸潤≥1/2 宮頸；行MRI 檢查示分為有無淋巴結轉移。并通過Kendall's tau-b 分析ESM-1、VEGF 與EMT相關蛋白E-Cadherin、Vimentin的相關性。

1.4 統計學方法數據均用SPSS 22.0 進行統計分析，采用χ2檢驗分析各組間差異，Kendall's tau-b 分析ESM-1 和VEGF 與EMT 的相關性，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常宮頸和宮頸鱗癌組織中ESM-1 和VEGF的陽性表達情況免疫組化結果顯示，ESM-1、VEGF、Vimentin 在宮頸鱗癌組織中的表達顯著高于正常宮頸組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；E-Cadherin 在宮頸鱗癌組織中的表達顯著低于正常宮頸組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 正常宮頸和宮頸鱗癌組織中ESM-1和VEGF的陽性表達率/例（%）

2.2 ESM-1 和VEGF 陽性率與宮頸鱗癌臨床病理特征的關系隨著宮頸鱗狀細胞癌FIGO 分期越高，ESM-1和Vimentin 陽性表達率越高，差異有統計學意義（χ2=17.24，14.72，P＜0.05），對VEGF 和ECadherin 陽性率的影響差異無統計學意義（χ2=0.05，0.91，P＞0.05）；隨著宮頸鱗狀細胞癌分化程度越高，E-Cadherin 和Vimentin 陽性表達率越高，差異有統計學意義（χ2=29.45，23.31，P＜0.05），對ESM-1 和VEGF 陽性率的影響差異無統計學意義（χ2=2.26，0.68，P＞0.05）；伴有淋巴結轉移病人的ESM-1、VEGF 及Vimentin 陽性率高于不伴有淋巴結轉移者，E-Cadherin 陽性率低于不伴有淋巴結轉移者，差異有統計學意義（χ2=4.03，11.65，24.38，31.57，P＜0.05）；隨著宮頸鱗狀細胞癌宮頸浸潤深度的增加，ESM-1 和VEGF 陽性表達率升高，差異有統計學意義（χ2=6.87，12.92，P＜0.05），對E-Cadherin 和Vimentin 陽性率的影響差異無統計學意義（χ2=1.58，1.53，P＞0.05）。見表2。

表2 ESM-1和VEGF陽性率與宮頸鱗癌臨床病理特征的關系/例（%）

2.3 宮頸組織中ESM-1 和VEGF 表達與EMT 的關系宮頸組織中，ESM-1 和VEGF 的表達與ECadherin 呈負相關，Spearman 列聯系數為（r=-0.46，-0.306，P＜0.05）；ESM-1和VEGF 的表達與Vimentin 的表達呈正相關，Spearman 列聯系數為（r=0.43，-0.36，P＜0.05）。結果提示，宮頸癌組織中異常高表達的ESM-1 和VEGF 可能參與了宮頸鱗癌的EMT過程。見表3。

表3 宮頸組織中ESM-1和VEGF與E-Cadherin、Vimentin表達的相關性分析

3 討論

子宮頸癌作為女性生殖系統第一大常見的惡性腫瘤，嚴重威脅病人的健康，其中子宮頸鱗癌占90%以上［9］。其發病機制目前尚不清楚，研究顯示其主要因素包括［10］：（1）長期細菌或者人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirs，HR-HPV）和皰疹病毒感染；（2）早婚、早育、多次妊娠等；（3）性行為過多過早；（4）宮頸長期慢性炎癥、持續的宮頸糜爛等；（5）長期口服避孕藥等。其中，HR-HPV 的慢性、持續性的感染是導致宮頸癌發生的重要誘因。隨著醫學進步，通過HPV 疫苗的接種及HPV 的篩查，宮頸癌的發病率盡管有所下降，但仍有大量女性因患宮頸癌而死亡［11］。人正常宮頸感染HR-HPV 后，宮頸上皮組織中的β-連環素表達降低，上皮細胞標記相關蛋白E-Cadherin 的表達下降，而間質細胞相關蛋白Vimentina 表達升高，細胞呈紡錘形發生EMT［12］，細胞侵襲、遷移能力增強。而侵襲、轉移是宮頸癌導致病人死亡的主要原因。

近期的腫瘤研究表明，EMT 與腫瘤原位浸潤及遠處轉移過程密切相關，在多種上皮性惡性腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等腫瘤進展過程的研究均發現EMT 現象，其促進腫瘤的侵襲、轉移、耐藥等，且病人預后較差［13-14］。據此，學者提出以針對EMT 來減少腫瘤的侵襲、轉移及復發進行治療［15-16］。EMT 是上皮細胞在某些因素的作用下，細胞的極性及細胞間黏附能力減弱、骨架重組，轉化為具有間質表型細胞，其遷移和運動能力增加。其主要特征包括：上皮性細胞標記分子E-Cadherin、α-連環素、β-連環素及緊密連接蛋白等表達下降，間質性細胞標記分子Vimentin、N-鈣黏蛋白及α-平滑肌肌動蛋白等表達升高；細胞間的相互作用丟失；細胞角蛋白細胞結構改變骨架轉化為Vimentin，演變為紡錘形纖維細胞形態，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得間質細胞的表型。E-Cadherin 是構成上皮細胞間黏附的重要成分，Vimentin 是一種中間絲蛋白，主要表達于間葉組織細胞中，異常表達會使細胞骨架蛋白構成改變［17-18］。提示，宮頸鱗癌組織中EMT 的發生是通過抑制E-Cadherin，β-連環素的表達以及促進Vinnetin 的表達實現的，及E-Cadherin的降低及Vimentin 表達的升高成為EMT 程序啟動的主要分子標識［19］。本研究發現，宮頸鱗癌上皮黏附蛋白標志物E-Cadherin 表達下降，間質標志物分子Vimentin 表達上調，提示發生EMT，與既往研究結果一致［20］。

又有研究表明，在腫瘤轉移、浸潤過程與腫瘤新生血管密切相關［21］。多項研究顯示VEGF 在腫瘤的發生發展、轉移及血管的生成等過程中有著極其重要的作用［22］。VEGF 廣泛存在于動物和人體的各種組織中，是血管衍生生長因子家族的成員，也是目前發現的調控血管生成特異性最高、作用最強的因子［23］。在局部組織缺血、創傷修復及炎癥反應等病理狀況刺激下可通過旁分泌和自分泌的方式在各種惡性腫瘤細胞中釋放，可增加細胞質內鈣聚集，改變血管內皮基因的表達方式，刺激內皮細胞有絲分裂，促進毛細血管通透性增加和新血管生成，還可調節淋巴微管的生成，促進腫瘤淋巴結的轉移［24］。ESM-1是近年發現的一種新型內皮細胞特異性分子，具有調節VEGF 的功能，能促進血管內皮細胞生長，改善腫瘤細胞的微環境［25］。故而，ESM-1、VEGF 與腫瘤的發生發展、轉移及浸潤的研究成為熱點。本實驗結果顯示，ESM-1 和VEGF 參與宮頸鱗癌的EMT，阻斷二者的表達可能為宮頸鱗癌靶向治療提供新的指導與靶點。

宮頸癌病人臨床Ⅰa～Ⅱa 期的病人手術為首選治療方案，而Ⅱb 期及以上病人的治療的標準方案是放療聯合含鉑藥物的化療。通過檢測宮頸鱗癌病人臨床Ⅰa～Ⅱa 期的病人宮頸組織中ESM-1 和VEGF 的表達情況及其與EMT 相關蛋白E-Cadherin和Vimentin 的關系，表明ESM-1 和VEGF 促進宮頸鱗癌病人EMT 的發生，并與E-Cadherin 呈負相關，與Vimentin 的表達呈正相關。然而ESM-1 和VEGF能否成為腫瘤靶向治療的靶點還仍受爭議。因地區、經濟及衛生等方面的差異，宮頸癌的發病率及死亡率不盡相同，相關蛋白表達率也有差異，而早期篩查及預防的不同，宮頸癌的分子標志物較難得到同意的標準。因而，確定宮頸癌的分子生物學特征，研究與宮頸癌的發生、發展及浸潤轉移相關的分子機制，有助于宮頸癌治療方案的制定、療效的預測和預后判定，并為宮頸癌的治療提供新的治療靶點。