熒光定量聚合酶鏈反應聯合抗酸染色在腎結核組織病理診斷中的應用

范正超，尹航，劉建震，朱曉黎，李崇斌

臨床肺外結核病占結核病的10%，泌尿生殖系結核占肺外結核病的30%～40%，尤以腎結核最為多見，是僅次于淋巴結核病的第二大肺外結核病，結核病發病率和死亡率均居我國傳染病之首［1-2］。病理學診斷是確診腎結核的重要手段，主要采用組織學蘇木素-伊紅（HE）染色及抗酸染色進行診斷。但由于組織學改變（肉芽腫性炎癥）有時不典型，有些其他細菌感染性病變如非結核分枝桿菌感染、真菌感染等亦可引起類似病理變化，鑒別診斷困難［3-4］，因此結核病的病原學診斷一直為人們所關注，其是感染性疾病的最終確診手段。結核病原學診斷有抗酸染色、結核桿菌培養、結核桿菌核酸基因檢測等。抗酸染色診斷結核病的靈敏度低，且不能有效區分非結核分枝桿菌、麻風桿菌、諾卡菌屬、軍團菌屬等抗酸染色陽性菌［5-6］；結核桿菌培養雖然診斷準確性高，但存在培養周期長、延誤藥物治療等問題［7］。近年來基因檢測技術發展迅速，為上述問題的解決提供了新的思路，如實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術在尿標本中可以檢測微量結核分枝桿菌特異基因序列，可為腎結核診斷提供更敏感、快速的依據［8］，但目前兩種方法的比較國內報道僅見于痰涂片，兩項技術應用在腎組織標本中的研究較少。故本研究應用實時熒光定量PCR 檢測技術在腎結核組織切片中檢測結核分枝桿菌特異基因序列，并與抗酸染色檢測技術進行對比，評估熒光定量PCR 技術聯合抗酸染色技術在腎結核病理診斷中的應用價值，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013 年6 月至2019 年6 月河北省胸科醫院泌尿外科手術切除、病理科保存的腎病石蠟包埋標本65 例，以病理診斷結果為分類標準，將術后明確診斷為腎結核的30 例納入陽性組（腎結核病組），其中男12 例，女18 例；病變位于左側14 例，右側16 例；年齡范圍為30～65 歲，年齡中位數為50.5（40.5，59.25）歲。術前均診斷為活動性無功能腎結核（患側），行后腹腔鏡或開放手術腎切除術，術后病理診斷均為腎結核。將同一時段因腎外傷、腎腫瘤等行腎切除術或保留腎單位部分切除術的35例納入陰性組（非結核病組），其中腎透明細胞癌15 例，腎盂癌7 例，無功能性腎結石6 例，腎乳頭狀細胞癌、創傷性腎碎裂傷、無功能性腎積水各2例，囊性腎癌1 例，其中男16 例，女19 例；病變位于左側15 例，右側20 例；年齡范圍為30～70 歲，年齡中位數為50（40，60）歲。術后病理均診斷為非結核病。兩組性別、腎臟患側、年齡等一般資料比較，均差異無統計學意義（P＞0.05），均有可比性。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

腎結核病納入標準：根據《中國結核病病理學診斷專家共識》［9］結核病病理診斷標準：①慢性肉芽腫伴壞死病變中找到經典結核結節；②慢性肉芽腫伴壞死組織中査到抗酸桿菌；③慢性肉芽腫伴壞死病變中未見經典結核結節或抗酸桿菌，但臨床細菌學或影像學檢查支持結核診斷，并且抗結核治療有效；以上三條具備其中一條即可。

1.2 儀器與方法

1.2.1 試劑及儀器抗酸染色試劑盒購自南京一基生化科技有限公司；石蠟包埋組織DNA 提取試劑盒、結核分枝桿菌核酸測定試劑盒均購自成都博奧晶芯生物科技有限公司。熒光定量PCR 儀，型號ABI 7500，為我院分子實驗室提供。

1.2.2 抗酸染色檢測石蠟組織標本切片厚4μm，常規二甲苯脫蠟并水洗。具體染色方法略，參見堿性復紅法（Ziehl-Neelsen）染色法［10］。結果判定：抗酸菌呈紅色桿狀，其他組織細胞或細菌呈藍色。

1.2.3 DNA 提取及PCR 擴增檢測 （1）所有石蠟組織標本連續切片5μm×10 張，置于消毒好的1.5 mL離心管中。（2）按照DNA 提取試劑說明書操作步驟提取組織標本DNA。（3）DNA 擴增：按照結核分枝桿菌核酸測定試劑盒說明書要求進行。PCR 反應條件：92 ℃1 min→60 ℃1 min→72 ℃1 min，30 個循環。在72 ℃進行熒光檢測。每批檢測標本均設置內標陽性對照。檢驗結果判定：Ct＜40 且擴增曲線呈典型S型為陽性，Ct≥40或無擴增曲線為陰性。

1.3 統計學方法利用SPSS 17.0 統計軟件進行數據處理，定量數據不滿足正態分布者采用兩組樣本比較的秩和檢驗（Mann-Whitney U），定性數據采用兩組樣本比較的χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件時選擇確切概率法，以α＝0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 熒光定量PCR 檢測及抗酸染色的檢測結果

本研究熒光定量PCR 檢測結核分枝桿菌內標陽性對照曲線呈S形且Ct值＜40，結核分枝桿菌特異基因擴增曲線呈典型S 型且Ct＜40 者為陽性，否則為陰性。抗酸染色檢測中呈亮紅色桿狀、略彎曲、串珠狀成堆或散在分布者為結核分枝桿菌（圖1A），陰性為淺藍色背景下不能檢出亮紅色桿菌（圖1B）。

2.2 熒光定量PCR 檢測與抗酸染色檢測的結果

本研究腎結核病組中抗酸染色陽性16例，假陰性14例，靈敏度53.3%；非結核病組中假陽性2 例，其中腎盂癌、無功能性腎積水各1例，進一步復查抗酸染色腎盂癌1例陰性，無功能性腎積水者仍為陽性，再進一步行結核分枝桿菌PCR 基因檢測為陰性，考慮為腎積水合并NTM 感染，余33 例均陰性，特異度為94.3%。熒光定量PCR 檢測腎結核病組中陽性25例，假陰性5 例，靈敏度為83.3%；非結核病組中假陽性1例，為患有腎透明細胞癌者，再進一步行PCR檢測復查結果轉為陰性，考慮為標本污染。非結核病組中陰性34 例，特異度為97.1%。熒光定量PCR檢測的靈敏度較抗酸染色檢測的靈敏度高，兩者差異有統計學意義（χ2=6.24，P=0.012）。熒光定量PCR 檢測的特異度、陽性預測值、陰性預測值均高于抗酸染色檢測的結果，但兩者比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。熒光定量PCR 檢測的準確性高于抗酸染色檢測的準確性，兩者比較差異有統計學意義（χ2=5.47，P=0.019），見表1，2。

表1 納入熒光定量聚合酶鏈反應與抗酸染色檢測結果/例

2.3 熒光定量PCR 聯合抗酸染色在腎組織結核分枝桿菌檢測的結果本研究抗酸染色與熒光定量PCR 聯合診斷腎結核，其中腎結核病組中陽性29例，假陰性1 例，靈敏度為96.7%；非結核病組中假陽性2 例，陰性33 例，特異度為94.3%。抗酸染色和熒光定量PCR 的靈敏度、陰性預測值、準確性均明顯高于抗酸染色、熒光定量PCR 單獨檢測值，差異有統計學意義（P＜0.05），聯合檢測的特異度、陽性預測值低于熒光定量PCR 單獨檢測值，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表3，4。

表2 熒光定量聚合酶鏈反應與抗酸染色檢測腎結核病原體的準確度比較/%

表3 納入熒光定量聚合酶鏈反應和抗酸染色聯合檢測的結果/例

3 討論

PCR 技術是一項革命性的分子生物學技術，該技術由Mullis 于1983 年發明，用于體外擴增特定DNA 片段，很快發展成生命科學研究不可或缺的手段。1989 年Hance 等將PCR 技術用于檢測臨床標本中的結核桿菌，為結核感染的病原學診斷提供了新的途徑。熒光定量PCR 技術進一步實現了從定性到定量的飛躍，具有特異度高、靈敏度高、定量準確、簡單易行等優點［11-14］。

結核分枝桿菌是人類結核病的病原菌，因此常將尋找病原菌作為結核疾病診斷的金標準。對于腎結核，尿結核桿菌培養最有診斷價值，但靈敏度變化較大（10.7%～90%），且存在培養周期長、延誤治療等問題；尿沉渣抗酸染色檢測存在靈敏度低（42.1%～52.1%），易污染，不能有效排除其他抗酸染色陽性菌干擾（如包皮垢分枝桿菌）等問題［15-16］。尿結核分枝桿菌DNA 檢測對結核桿菌具有較高的靈敏度。國外有研究報道以尿結核分枝桿菌培養陽性為金標準，PCR 檢測尿結核分枝桿菌的靈敏度達95.6%，特異度達98.1%，而國內有研究報道的靈敏度為80%，特異度為78.5%［17-18］。因尿標本中存在某些擴增抑制藥物或標本易被污染等問題，使得該檢查易出現假陰性或假陽性結果。因此尿結核分枝桿菌DNA 檢測結果必須結合培養、影像學或活檢標本的組織學檢查結果方能確立診斷。

表4 抗酸染色、熒光定量PCR及抗酸染色和熒光定量PCR對腎結核病原體檢測準確度的比較/%

相對在腎結核病人尿液標本的結核分枝桿菌病原菌檢測研究報道，我們在本研究中采用對腎結核組織標本病原菌檢測靈敏度較高的熒光定量PCR 和抗酸染色技術，以臨床確診的無功能腎結核的腎臟切除標本（病理診斷為結核病）為陽性對照，以非腎結核病變的腎臟切除標本（病理診斷排除結核病）為陰性對照，分別研究、比較兩種檢測方法單獨應用的檢測準確度和兩個指標聯合應用平行檢測在腎結核病理診斷中的應用價值。

在本研究中我們發現：（1）熒光定量PCR 技術在腎結核確診病例組織切片中檢測的靈敏性為83.3%，與文獻報道的在尿沉渣液體標本中檢測的靈敏度80.0%～95.6%有一定差距，提示熒光定量PCR 檢測靈敏度在不同介質標本（液體、固體組織）中有差別，臨床應用中應注意相關區別。考慮可能原因如下：①與結核病病灶是否處于活動期有關，尿標本熒光定量PCR 檢測多用于臨床診斷，大多數病例結核病處于活動期，細菌量大，而本研究中手術切除的腎結核均已行充分抗結核治療，病灶組織中的細菌量大幅度降低，導致陽性率下降；②石蠟組織標本經固定、脫水等處理過程影響，結核桿菌DNA 的檢出率降低，這需要進一步的實驗論證。（2）腎組織熒光定量PCR 檢測的靈敏性較抗酸染色檢測的靈敏度提高30.0%，差異有統計學意義。腎組織熒光定量PCR 檢測的準確率也明顯高于抗酸染色的檢測結果，差異有統計學意義，充分提示在腎結核病理診斷中，熒光定量PCR 技術較抗酸染色技術在病原學檢測方面具有更大的應用價值。（3）在本研究中，我們進一步探索了抗酸染色聯合熒光定量PCR 檢測在腎結核組織標本中檢測的準確度，我們發現兩種指標聯合檢測的靈敏性、陰性預測值、準確性均明顯高于單獨任何一種檢測的指標值，充分提示抗酸染色檢測聯合熒光定量PCR 檢測在腎結核病理診斷中擁有更好的檢測準確度。在本研究陰性組（非結核病組）中熒光定量PCR 檢測假陽性1 例，經復測轉為陰性，提示與在石蠟標本處理、DNA 提取過程中標本間污染有關，需進一步加強實驗室的清潔、消毒工作，提高檢測過程的質量控制標準。非結核病組中抗酸染色檢測假陽性2 例，腎盂癌1 例，無功能性腎積水1 例，進一步復查抗酸染色腎盂癌1 例轉為陰性，考慮與標本之間污染有關外；無功能性腎積水者仍為陽性，再進一步行結核分枝桿菌PCR 基因檢測轉為陰性，考慮為腎積水合并NTM 感染，再次提示抗酸染色檢測不能有效區分非結核分枝桿菌（如包皮垢分枝桿菌）、諾卡菌屬、軍團菌屬等抗酸染色陽性菌感染，抗酸染色陽性者可進一步行熒光定量PCR 檢測或結核桿菌培養區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，提高檢測的特異度。

本研究陽性組（腎結核病組）中組織熒光定量PCR 檢測陽性25 例，其中12 例抗酸染色陽性，13 例抗酸染色陰性，分析可能原因：抗酸染色檢測的靈敏度低于熒光定量PCR 的檢測結果，在行充分抗癆治療后組織標本結核菌量水平明顯降低的情況下，抗酸染色的靈敏度會進一步降低，假陰性率升高。腎結核組中抗酸染色檢測陽性16例，其中例熒光定量PCR 檢測陽性12 例，4 例陰性，考慮可能原因：抗酸染色陽性標本中存在擴增反應抑制物，抑制PCR擴張，導致熒光定量PCR 檢測出現假陰性。筆者查閱最近文獻，以抗酸染色聯合熒光定量PCR 技術檢測腎結核組織標本用于病理診斷的研究報道較少，兩種方法聯合檢測文獻亦較少，且以熒光定量PCR聯合痰涂片抗酸染色為主。本文研究結果提示熒光定量PCR 檢測聯合抗酸染色檢測可提高腎結核組織標本病原體檢測的靈敏性、陰性預測值和準確性，在腎結核的病理診斷中具有良好的應用價值。

但本研究有一定的局限性，首先本研究為單中心、小樣本研究，研究結果缺乏廣泛的代表性，需進一步擴大研究中心、增加樣本量；其次，本研究未行組織標本的結核分枝桿菌培養，檢測方法指標的比較缺乏一定的說服力，需在下一步研究中改進。

（本文圖1見插圖5-2）