宮頸鱗癌組織中泛素偶聯酶E2、食管癌相關基因4表達情況與預后的關系

饒云霞，陳新生

宮頸鱗癌約占所有宮頸癌70%以上，其在50～55 歲人群中發病率較高，且有年輕化趨勢［1］。由于臨床篩查和治療水平提高，近年來宮頸鱗癌早期病人預后有明顯改善，但中晚期病人治療效果不明顯，5年生存率仍較低［1］。因此探究宮頸鱗癌相關因子有助于病人病情、臨床療效評估和病人預后改善。Qin 等［2］研究表明，泛素偶聯酶E2（ubiquitin conjugating enzyme E2，UBE2C）在乳腺癌中高表達，與癌細胞對阿霉素敏感性降低和病人不良預后發生有關。有研究證實，子宮內膜癌組織中UBE2C 表達水平明顯升高，預示病人晚期組織學分級、FIGO分期、復發和較短生存期。UBE2C 敲低可抑制子宮內膜癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間充質轉化［3］。有研究報道，與正常食管組織比較，食管癌組織中食管癌相關基因4（esophageal cancerrelated gene 4，ECRG4）水平顯著下降，與癌細胞凋亡、周期、轉移調控相關蛋白表達變化有關［4］。Tang 等［5］研究發現，乳腺癌組織中ECRG4 表達水平降低，過表達ECRG4 可導致G0/G1 期細胞周期停滯，抑制乳腺癌細胞增殖和遷移。本研究通過檢測宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA 及蛋白表達水平，分析二者在宮頸鱗癌發生發展中作用及與預后關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取天門市第一人民醫院收治的宮頸鱗癌病人73例，選取時間為2010年6月至2014年6 月，病人年齡（51.26±16.83）歲，范圍為37～71歲；其中有吸煙史19 例，孕次（2.35±0.71）次，產次（1.76±0.58）次。納入標準：①均確診為宮頸鱗癌［6］；②入組前未進行任何治療；③臨床資料完整。排除標準：①妊娠期、哺乳期病人；②合并患有其他婦科惡性腫瘤；③嚴重心、腎、肝臟功能不足病人。入組宮頸鱗癌病人根據FIGO 分期標準［6］，可分為：Ⅰ期10 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期45 例。其中Ⅰ～Ⅱ期病人行子宮廣泛性切除+盆腔淋巴切除術，術后行輔助放療5例：盆腔外、腹主動脈旁淋巴結照射（每次2 Gy，共40 Gy），陰道殘端腔內照射（每次10 Gy，2～4 次）；術后行輔助化療12 例：紫杉醇（75 mg/m2）+鉑類（順鉑80 mg/m2）藥物進行全身化療，3 周1 療程；術后行放化療結合治療11例：采用體外+腔內放療方案，輔以紫杉醇（75 mg/m2）+鉑類（順鉑80 mg/m2）藥物治療。Ⅲ期病人行均行放化療結合治療：盆腔外、腹主動脈旁淋巴結照射（每次2 Gy，共80 Gy），陰道殘端腔內照射（每次10 Gy，5～7 次）；輔以紫杉醇（135 mg/m2）+鉑類（順鉑80 mg/m2）藥物治療，3 周1 療程，治療2個療程以上。

另選取同期本院收治的宮頸上皮瘤變病人62例為宮頸上皮瘤變組，病人年齡（50.52±15.89）歲，范圍為35～70 歲；其中有吸煙史13 例，孕次（2.16±0.64）次，產次（1.51±0.52）次。納入標準：①經陰道鏡、宮頸液基細胞學、病理學診斷，確診為宮頸鱗狀上皮內瘤變［7］；②臨床資料完整。排除標準：①有宮頸手術、盆腔放療史；②有腫瘤藥物治療史；③妊娠期病人。入組上皮瘤變病人根據病理組織活檢結果分為CIN Ⅱ級36例，CIN Ⅲ級26例。

選取同期行全子宮切除術的54 例子宮肌瘤病人為對照組，收集正常的宮頸組織（均經過病理檢查），年齡（51.83±17.34）歲，范圍為36～73歲；病人中有吸煙史9例，孕次（2.12±0.65）次，產次（1.37±0.43）次。納入標準：①經病理學診斷和超聲檢查，確診為子宮肌瘤［8］；②臨床資料完整。排除標準：①近期無藥物治療史；②妊娠期、哺乳期病人；③未合并其他疾病。三組病人一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究所有受試者均已簽署知情同意書，本研究經天門市第一人民醫院倫理委員會批準同意（20100427）。

1.2 主要儀器和試劑實時熒光定量（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（型號7500，美國ABI 公司）、RNA 提取試劑盒和免疫組織化學染色試劑盒（貨號665077、1171939，德國Roche公司）、反轉錄試劑盒和qRT-PCR 試劑盒（貨號RR047A、RR820A，日本Takara 公司）、兔抗人ECRG4 多克隆抗體（貨號ABP56758，美國Abbkine 公司）、兔抗人UBE2C 多克隆抗體（貨號PAB6221，臺灣Abnova 公司）、羊抗兔IgG二抗（貨號211-035-109，美國Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集術中分別收集Ⅰ～Ⅱ期宮頸鱗癌病人宮頸鱗癌組織、宮頸上皮內瘤變病人瘤變組織和子宮肌瘤病人正常宮頸組織，Ⅲ期宮頸鱗癌病人病理組織于病理檢查時留存。將所得組織分為兩份，一份保存于-80 ℃，用于檢測UBE2C、ECRG4 mRNA 表達水平；另一份制成4 μm 厚石蠟切片，用于檢測UBE2C、ECRG4蛋白表達。

1.3.2 UBE2C、ECRG4 mRNA 表達水平檢測采用qRT-PCR 檢測UBE2C、ECRG4 mRNA 表達水平，首先取收集組織在液氮中研磨，按照Trizol 法提取總RNA，然后反轉錄獲得cDNA。反應體系（20μL）如下：cDNA 2 μL，ROX 0.4 μL，Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，dH2O 6.0 μL。反應步驟：95 ℃、30 s，1循環；95 ℃、5 s；65 ℃、15 s，40 循環；72 ℃、30 s。用2-ΔΔCt法計算UBE2C、ECRG4 mRNA 相對表達量。引物如表1所示。

1.3.3 UBE2C、ECRG4 蛋白表達水平檢測UBE2C、ECRG4 蛋白表達水平按照免疫組織化學染色法進行檢測。隨機選取6 個視野（×400）觀察，UBE2C、ECRG4 蛋白陽性細胞主要表達于細胞質，染色為棕黃色或棕褐色顆粒。染色強度：無、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2、3 分；陽性細胞百分比：＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別為0、1、2、3、4分。根據染色強度和陽性細胞百分比評分乘積，將UBE2C、ECRG4 蛋白分為高表達（＞4分）和低表達（≤4分）［9］。

1.4 隨訪病人出院后，對73 例病人隨訪5 年，隨訪方式為打電話或復查，隨訪間隔為3 個月1 次，結束時間為2019 年6 月。隨訪結束后進行統計，并分析不同UBE2C、ECRG4 蛋白表達水平病人生存情況。無失訪病例。

1.5 統計學方法用SPSS 23.0 軟件對數據進行分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，差異有統計學意義再采用SNK-q檢驗；計數資料用例（%）表示，用χ2檢驗；采用Pearson 法分析宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA 表達水平相關性；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，分析不同UBE2C、ECRG4 蛋白表達水平病人5 年總生存率，行log-rank 檢驗；采用Cox 回歸模型進行危險因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組UBE2C、ECRG4 mRNA 表達水平比較與正常宮頸組織相比，宮頸上皮內瘤變組織和宮頸鱗癌組織中UBE2C mRNA 表達水平明顯升高，ECRG4 mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。與宮頸上皮內瘤變組織相比，宮頸鱗癌組織中UBE2C mRNA表達水平明顯升高，ECRG4 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組泛素偶聯酶E2（UBE2C）、食管癌相關基因4（ECRG4）mRNA表達水平比較/±s

表2 各組泛素偶聯酶E2（UBE2C）、食管癌相關基因4（ECRG4）mRNA表達水平比較/±s

注：①與正常宮頸組織比較，P＜0.05。②與宮頸上皮內瘤變組織比較，P＜0.05。

組別正常宮頸組織宮頸上皮內瘤變組織宮頸鱗癌組織F值P值例數54 62 73 UBE2C mRNA 1.01±0.29 1.97±0.63①3.64±1.21①②157.71 0.000 ECRG4 mRNA 1.02±0.31 0.75±0.26①0.51±0.19①②63.72 0.000

2.2 各組UBE2C、ECRG4 蛋白表達水平比較UBE2C、ECRG4 蛋白主要表達于細胞質中，見圖1。正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變組織、宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 蛋白高表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組泛素偶聯酶E2（UBE2C）、食管癌相關基因4（ECRG4）蛋白表達水平比較/例（%）

2.3 宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 蛋白表達水平與臨床病理特征關系不同分化程度病人癌組織中UBE2C 蛋白高表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同分化程度病人癌組織中ECRG4 蛋白高表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。FIGO分期Ⅲ期、淋巴結轉移病人UBE2C 蛋白高表達率明顯高于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移病人（P＜0.05），ECRG4 蛋白高表達率明顯低于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移病人（P＜0.05）。不同年齡、腫瘤直徑宮頸鱗癌病人癌組織中UBE2C、ECRG4蛋白高表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 泛素偶聯酶E2（UBE2C）、食管癌相關基因4（ECRG4）蛋白表達與臨床病理特征關系/例（%）

2.4 宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA表達水平相關性宮頸鱗癌組織中UBE2C mRNA 與ECRG4 mRNA 表達水平呈負相關（r=-0.52，P=0.000）。見圖2。

圖2 宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA表達水平相關性

2.5 UBE2C、ECRG4 蛋白表達水平與宮頸鱗癌病人預后關系 UBE2C 高表達組生存17 例，死亡33例，5 年總生存率為34.00%；UBE2C 低表達組生存15 例，死亡8 例，5 年總生存率為65.22%，UBE2C 高表達組與低表達組5 年總生存率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。ECRG4高表達組生存14例，死亡5 例，5 年總生存率為73.68%；ECRG4 低表達組生存18例，死亡36例，5年總生存率為33.33%，ECRG4高表達組與低表達組5 年總生存率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.6 宮頸鱗癌病人不良預后危險因素分析 FIGO分期Ⅲ期、淋巴結轉移、UBE2C高表達、ECRG4低表達是影響宮頸鱗癌病人發生不良預后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表5。

表5 Cox回歸模型宮頸鱗癌病人不良預后危險因素分析

3 討論

UBE2C 又稱泛素結合酶（UBH10），屬于泛素偶聯酶E2 家族，位于人類染色體20q13.12 區，有6 種同源異構體，在泛素蛋白酶體有絲分裂調控系統中發揮重要生物學作用［10］。有研究報道，直腸癌組織中UBE2C 表達水平明顯上調，體外干擾其表達可抑制細胞增殖、遷移和侵襲［10］。本研究得出，UBE2C mRNA 和蛋白表達上調可能與宮頸癌發生有關。Hu 等［11］研究證實，下調UBE2C 表達可抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲和提高前列腺癌小鼠存活率。本研究結果顯示，不同分化程度病人癌組織中UBE2C高表達率比較差異有統計學意義，且FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結轉移病人UBE2C 蛋白高表達率明顯高于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移病人，提示UBE2C 蛋白表達水平升高可能與宮頸鱗癌進展有關。Jin等［12］研究發現，UBE2C在非小細胞肺癌組織中表達水平高于癌旁組織，可通過靶向結合上皮細胞標記蛋白E-cadherin 抑制因子ZEB1/2 轉錄本的5'-UTR 來促進肺癌細胞間充質轉化，影響癌細胞周期和抑制凋亡來促進非小細胞肺癌進展和轉移。上述研究提示UBE2C 可能通過上調細胞上皮間充質轉化促進宮頸鱗癌發生發展。

ECRG4 位于人類染色體2q14.1-14.3 上，是一種由148個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白。肺癌細胞中ECRG4 表達下調，體外過表達ECRG4 可降低肺癌細胞增殖能力［13］。本研究通過檢測ECRG4 mRNA和蛋白表達，發現ECRG4表達下調可能預示宮頸鱗癌發生。有研究表明，胃癌組織中ECRG4 表達下調，與腫瘤淋巴結轉移密切相關，可能作為胃癌治療靶點［14］。本研究結果顯示，不同分化程度病人癌組織中ECRG4蛋白高表達率比較，差異有統計學意義。FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結轉移病人ECRG4 蛋白高表達率明顯低于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移病人，提示ECRG4 可能參與宮頸鱗癌進展，癌組織中ECRG4 蛋白高表達率升高與可能與腫瘤分化程度降低、FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結轉移發生有關。Ge等［15］研究證實，ECRG4表達下調可影響上皮間充質轉化相關標志物水平，促進肝癌細胞增殖和遷移，提示ECRG4 可能影響上皮間充質轉化過程，參與宮頸鱗癌進展。

Li 等［16］研究表明，ECRG4 在食管癌中表達下調，ECRG4 過表達可通過下調UBE2C，影響癌細胞NF-κB 核易位，誘導細胞凋亡及抑制細胞增殖。本研究利用Peason 法對宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA 表達進行了相關性分析，結果顯示二者呈負相關，提示宮頸鱗癌組織中ECRG4也可能通過靶向調節UBE2C表達，影響宮頸鱗癌發生發展。

Zhang 等［17］研究報道，胃癌組織中UBE2C 過表達與病人預后不良有關，UBE2C 表達、淋巴結轉移、TNM 分期是病人預后獨立影響因素。Chen 等［18］研究發現，鼻咽癌組織中ECRG4蛋白表達水平明顯低于癌旁組織，與淋巴結轉移、臨床分期呈負相關，是病人生存期較低的獨立影響因素。本研究結果顯示，UBE2C蛋白高表達組和ECRG4蛋白低表達組病人5 年總生存率較低，提示UBE2C 高表達、ECRG4低表達可能導致宮頸鱗癌病人術后5 年低生存率。本研究還發現，UBE2C 高表達、ECRG4 低表達、FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結轉移是影響病人不良預后的獨立危險因素，進一步提示UBE2C 高表達、ECRG4低表達與宮頸鱗癌不良預后發生有關。

綜上所述，宮頸鱗癌組織中UBE2C mRNA 表達水平及蛋白高表達率明顯升高，ECRG4 mRNA 表達水平及蛋白高表達率降低，與病人臨床病理特征及5 年總生存率低有關，可能作為評估病人不良預后的預測指標。但由于本研究方法較為簡單，具體作用機制還需進一步探究。

（本文圖1見插圖5-1）

圖1 UBE2C、ECRG4蛋白表達（免疫組化染色×400）：A為UBE2C蛋白在正常宮頸組織中低表達；B為UBE2C蛋白在宮頸鱗癌組織中高表達；C為ECRG4蛋白在宮頸鱗癌組織中低表達；D為ECRG4蛋白在正常宮頸組織中高表達