人參皂苷Rh2調控微小RNA-133a-3p對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響

周自廣

瘢痕疙瘩是一種以纖維增生為特征的皮膚病，通常難以治愈，如果治療不當，會導致病人出現嚴重的情緒和身體痛苦；其手術切除極易復發，現在多用藥物進行治療［1］。瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblasts，KF）的異常增殖和凋亡是導致瘢痕疙瘩的主要原因［2］。研究表明中藥可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，有效防治瘢痕疙瘩［3］。人參皂苷有多種有效單體成分，研究發現人參皂苷Rb1 能抑制活性細胞增殖，血管生成減少，膠原合成減少，有效改善兔耳瘢痕的增生［4］。人參皂苷R3 可誘導成纖維細胞凋亡，抑制病理學瘢痕的形成［5］。人參皂苷Rh2 能抑制肝癌細胞生長并促進其凋亡［6］。而人參皂苷Rh2對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響及其機制尚不清楚。miRNA 在瘢痕疙瘩的發展中發揮著不可替代的作用［7］。研究發現，miR-133a-3p 對胃癌細胞增殖［8］、結直腸癌細胞增殖［9］具有抑制作用，還能促進結直腸癌細胞凋亡［9］。然而miR-133a-3p 對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響也不清楚。本研究自2019年3—9月研究人參皂苷Rh2和miR-133a-3p對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料人參皂苷Rh2 購自西安瑞林生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒、熒光定量試劑盒購自美國Progema 公司；miScript Reverse Transcription Ⅱ試劑盒購自上海Qiagen；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒購自江蘇Beyotime Biotechnology；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）試劑盒購自北京Solarbio 公司；抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人瘢痕疙瘩成纖維細胞的分離培養無菌條件下將手術切除的人瘢痕疙瘩組織去除表皮及脂肪組織，用含100 U/mL 青霉素和100 g/L 鏈霉素的PBS洗滌3次，剪碎成組織微粒，后用DMEM 培養基置于37 ℃，含5%二氧化碳恒溫箱培養，每2～3天換液一次，1 周后在顯微鏡下觀察，待組織微粒周圍有梭形細胞游出后，吸去組織塊和培養液，換新鮮培養液繼續培養，用蘇木精-伊紅染色鑒定確為瘢痕疙瘩成纖維細胞后繼續繼代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞處理與分組取對數生長期KF，分別用濃度為50、100、200 mg/L的人參皂苷Rh2培養，未給人參皂苷Rh2 記為對照（NC）組；將miR-NC、miR-133a-3p 分別轉染至KF 中記為miR-NC 組、miR-133a-3p組；將anti-miR-NC、anti-miR-133a-3p分別轉染至KF 再用200 mg/L 的人參皂苷Rh2處理記為anti-miR-NC+人參皂苷Rh2 組、anti-miR-133a-3p+人參皂苷Rh2組。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 Annexin V-FITC/PI 試劑盒用于檢測KF 凋亡。各組KF 在25 ℃的黑暗環境中用Annexin V-FITC 和PI 染色10 min。在FACSCantoⅡ流式細胞儀上分析細胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測miR-133a-3p表達水平各組KF 培養48 h 后提取細胞總RNA，在RNA 被miScript Reverse Transcription Ⅱ試劑盒逆轉錄后，miRNA qRT-PCR 試劑盒用于測量miR-133a-3p 表達，PCR擴增反應在95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，40 cycles；60 ℃延長5 min的循環條件下進行。采用2-△△Ct法計算結果。引物序列為（5'-3'）：miR-133a-3p 正向：ACACTCCAGCTGGGTTGGTCCCCTTCAACC，反向：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACA；U6（內參）正向：CTCGCTTCGGCAGCACA， 反向 ： AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.5 蛋白質印跡（Western blotting）法檢測裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved caspase-3）、β-連環素（β-catenin）蛋白表達各組KF 培養48 h后，將RIPA 裂解溶液在冰上裂解KF 20 min。使用BCA 試劑盒測量樣品蛋白質濃度水平。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后立即將其轉移到聚偏二氟乙烯膜上，在25℃下，將蛋白與5%脫脂奶粉一起孵育1 h，在4 ℃下，使用一抗（1∶1 000）孵育蛋白12 h，然后與二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h，用ECL 發光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統成像，用Quantity One 凝膠分析以β 肌動蛋白（β-actin）為內參分析蛋白條帶的灰度以檢測表達差異。

1.3 統計學方法實驗數據經SPSS 20.0 分析，計量資料用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度人參皂苷Rh2對KF凋亡的影響與對照組相比，50、100、200 mg/L 的人參皂苷Rh2培養KF 中細胞凋亡率升高［（9.08±0.91）%、（16.28±1.63）%、（23.18±2.32）%比（4.29±0.43）%，P＜0.05］。

2.2 人參皂苷Rh2 對miR-133a-3p 表達的影響與對照組（1.00±0.10）相比，200 mg/L 人參皂苷Rh2組miR-133a-3p 表達水平（3.64±0.36）升高（t=12.24，P＜0.05）。

2.3 高表達miR-133a-3p 對KF 凋亡的影響 miR-133a-3p組KF中miR-133a-3p表達水平比miR-NC組升高，Cleaved caspase-3 表達水平也比miR-NC 組升高，細胞凋亡率比miR-NC 組升高（P＜0.05）。見圖1，表1。

表1 高表達miR-133a-3p對KF凋亡的影響/±s

表1 高表達miR-133a-3p對KF凋亡的影響/±s

注：Cleaved caspase-3為裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。

組別miR-NC miR-133a-3p t值P值重復次數33 miR-133a-3p 1.00±0.11 2.76±0.28 10.13 0.001 Cleaved caspase-3 0.32±0.03 0.86±0.09 9.86 0.001凋亡率/%4.37±0.44 15.72±1.57 12.06＜0.001

圖1 Western blotting檢測高表達miR-133a-3p后Cleaved caspase-3蛋白表達

2.4 低表達miR-133a-3p 可以部分逆轉人參皂苷Rh2 對KF 凋亡的影響與anti-miR-NC 組相比，anti-miR-133a-3p 組KF 中Cleaved caspase-3 表達水平降低，細胞凋亡率降低（P＜0.05）；anti-miR-133a-3p+人參皂苷Rh2組KF中miR-133a-3p表達水平比antimiR-NC+人參皂苷Rh2 組降低，Cleaved caspase-3 表達水平也比anti-miR-NC+人參皂苷Rh2 組降低，細胞凋亡率降低（P＜0.05）（圖2，表2）。

表2 低表達miR-133a-3p可以部分逆轉人參皂苷Rh2對KF凋亡的影響/±s

表2 低表達miR-133a-3p可以部分逆轉人參皂苷Rh2對KF凋亡的影響/±s

注：Cleaved caspase-3為裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。①與anti-miR-NC比較，P＜0.05。②與anti-miR-NC+人參皂苷Rh2比較，P＜0.05。

組別anti-miR-NC anti-miR-133a-3p anti-miR-NC+人參皂苷Rh2 anti-miR-133a-3p+人參皂苷Rh2 F值P值重復次數3333 miR-133a-3p 1.00±0.10 0.30±0.03①0.96±0.10 0.45±0.05②64.94＜0.001 Cleaved caspase-3 0.30±0.03 0.10±0.01①0.98±0.10 0.42±0.04②138.75＜0.001凋亡率/%4.30±0.45 1.01±0.10①23.08±2.31 7.26±0.73②189.54＜0.001

圖2 低表達miR-133a-3p可以部分逆轉人參皂苷Rh2對KF中Cleaved caspase-3蛋白的影響

2.5 Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白的表達人參皂苷Rh2 組KF 中β-catenin 表達水平低于NC 組［（0.38±0.04）比（0.80±0.08），P＜0.05］；anti-miR-133a-3p+人參皂苷Rh2 組KF 中β-catenin 高于antimiR-NC+人參皂苷Rh2 組［（0.71±0.07）比（0.42±0.05），P＜0.05］。見圖3。

圖3 Western blotting檢測β-catenin蛋白的表達

3 討論

瘢痕疙瘩的治療選擇范圍廣泛，這些治療方案都有各自優勢，但副作用和復發的高風險仍然存在［10］。因此，確定用于治療瘢痕疙瘩的改進的治療方法或藥物是緊迫且非常重要的。研究發現人參皂苷Rg3 處理后，KF 的增殖、遷移、侵襲、血管生成和膠原合成受到顯著抑制，人參皂苷Rg3 可作為治療瘢痕疙瘩病人的可靠藥物［11］。人參皂苷Rg1能抑制心肌成纖維細胞的增殖，減少高糖培養心肌成纖維細胞膠原和TGF-β1的分泌，抑制Wnt信號通路的異常表達［12］。說明人參皂苷具有抑制瘢痕形成的作用，且可能與部分信號通路有關。還有研究發現人參皂苷Rh2通過下調Wnt/β-catenin信號通路抑制SHG44 細胞增殖，誘導細胞凋亡［13］。本研究結果顯示，不同濃度人參皂苷Rh2處理的KF中細胞凋亡率升高。說明人參皂苷Rh2可促進瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，也具有抑制瘢痕形成的作用。

研究發現上調miR-133a-3p 抑制食管鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡［14］。miR-133a-3p 過表達通過調控糖原磷酸化酶B（glycogen phosphorylase B，PYGB）/Wnt/β-catenin信號通路抑制卵巢癌細胞的增殖，侵襲和遷移［15］。本研究結果顯示，過表達miR-133a-3p，Cleaved caspase-3表達水平升高，細胞凋亡率升高。說明過表達miR-133a-3p 可促進瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡。且人參皂苷Rh2培養KF 后，miR-133a-3p表達增強，人參皂苷Rh2對KF 凋亡的促進作用被低表達miR-133a-3p所部分逆轉。表明人參皂苷Rh2 可能通過上調miR-133a-3p表達促進瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡。

Wnt/β-catenin 信號通路在細胞增殖、遷移和凋亡中起重要作用，β-catenin 是該信號通路發關鍵因子，β-catenin 高表達可激活Wnt/β-catenin 信號通路，進而促進細胞增殖，抑制細胞凋亡［16］。Wnt/βcatenin 信號通路與病理性瘢痕的形成密切相關［17］。研究發現沉默β-catenin 能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并促進其凋亡［18］。本研究數據表明，人參皂苷Rh2 處理的KF 中β-catenin 表達水平降低，低表達miR-133a-3p 部分逆轉了人參皂苷Rh2 對βcatenin 的抑制作用。以上結果表明，人參皂苷Rh2可抑制Wnt/β-catenin 信號通路激活，其可能是通過調控miR-133a-3p實現的。

綜上所述，人參皂苷Rh2 可促進瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，其機制可能與miR-133a-3p 和Wnt/βcatenin信號通路有關。