基于質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)時(shí)間飛行質(zhì)譜（PTR-TOF-MS） 結(jié)合多變量分析識別不同種類的建陽白茶

吳偉華

（閩江師范高等專科學(xué)校 化學(xué)與生物工程系，福建福州 350018）

白茶因其獨(dú)特的品味和一定的保健功能受到越來越多的關(guān)注。白茶根據(jù)加工原料的嫩度等級的不同，一般可以分為四種：白毫銀針、白牡丹、貢眉和壽眉。而每個種類因其原料和茶葉加工方法等不同因素，所生產(chǎn)出來的茶葉帶有獨(dú)特的芳香。因此每一種白茶都必須標(biāo)明其種類，以便市場對其進(jìn)行產(chǎn)品認(rèn)證和定價(jià)。

茶葉香氣是茶葉中由嗅覺感知到的有香味的物質(zhì)的總稱，香氣的形成受到產(chǎn)地、品種、種類、加工工藝等因素綜合影響的結(jié)果。因此研究茶葉中的香氣組成，通過不同種類白茶的香氣之間存在的差異性建立判別模型具有一定的研究價(jià)值。

近年來，越來越多科研工作者進(jìn)行白茶領(lǐng)域的研究，呂海鵬等[1]采用HPLC技術(shù)對不同花色種類白茶的茶湯中抗氧化活性及其主要品質(zhì)化學(xué)成分進(jìn)行相關(guān)分析。孫威江等[2]采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)揭示了不同等級的白牡丹單白茶中不同的化學(xué)成分。邵淑賢等[3]采用ATD-GC-MS 技術(shù)對不同品種白牡丹茶的香氣成分進(jìn)行相關(guān)分析，色譜技術(shù)雖然在白茶研究方面應(yīng)用較多，但提取和分離需要特定的預(yù)處理，在預(yù)處理方面存在耗時(shí)較長，色譜柱的特點(diǎn)和局限性制約其提取效率。

PTR提供了一種利用H3O+離子親質(zhì)子化VOCs的軟化學(xué)電離方法，因此無須任何處理即可直接測定VOCs。TOF質(zhì)量分析儀能夠在超高質(zhì)量分辨率下（低至幾個ng/L）測量VOCs。質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)時(shí)間的飛行-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（PTR-TOF-MS）因其本身無須進(jìn)行樣品前處理，可以直接測定揮發(fā)性有機(jī)化合物，可以更加真實(shí)反映香氣本身組成結(jié)構(gòu)，因此近幾年來也開始被相關(guān)科研工作者運(yùn)用到白茶香氣的研究領(lǐng)域中。

本研究對建陽區(qū)生產(chǎn)的不同種類白茶樣品中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行了PTR-TOF-MS分析，并結(jié)合雙向正交偏最小二乘-判別分析（O2PLS-DA）判別模型進(jìn)行不同種類白茶的比較、鑒別，為白茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供種類鑒定技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，收集了建陽區(qū)產(chǎn)地生產(chǎn)的4個不同種類的20份樣品：白牡丹5份、壽眉5份、貢眉5份、白毫銀針5份。分析檢測前樣品在常溫下保存在鋁箔袋中。

PTR-TOF-MS1000型質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜，奧地利Ionicon Analytik公司；G1888型頂空自動進(jìn)樣器，安捷倫公司；XB124型精密電子天平，上海精密公司；5182-0837型20ml帶蓋螺紋玻璃瓶安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品制備。準(zhǔn)確稱取1g干茶葉并置于20mL頂空瓶中，再將20mL頂空瓶放入80℃水浴鍋中進(jìn)行加熱10min，使茶葉中香氣充分釋放出來。

（2）測試條件。漂移管的儀器條件設(shè)置為：漂移電壓640V，漂移溫度60℃，漂移壓力225Pa，E/N值（電場強(qiáng)度/氣量密度）為140Townsend（Td，1Td= 10-17V·cm2），漂移流量為40sscm，質(zhì)譜掃描范圍m/z 30～300。每個茶葉準(zhǔn)備平行樣3個，每個平行樣分析檢測3次。每個樣本測量30s，取測量數(shù)據(jù)取平均值。用同樣的方法測量空白值。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

PTR-TOF-MS的數(shù)據(jù)處理包括固定時(shí)間校正、內(nèi)部校準(zhǔn)、提取質(zhì)荷比。茶葉樣品提取整數(shù)質(zhì)荷比的范圍在30～300，消除干擾離子（O2+、NO+和水簇離子）及其同位素的質(zhì)譜峰。

采用SIMCA-p 14.1軟件（Umetrics AB，Umea，瑞典）進(jìn)行主成分分析（PCA）和雙向正交偏最小二乘-判別分析（O2PLS-DA）。將所有質(zhì)譜峰的響應(yīng)值作為變量，所有的變量均以均值為中心，初步進(jìn)行主成分分析（PCA）。在PCA判別模型能識別4個種類白茶的前提下，進(jìn)行雙向正交偏最小二乘-判別分析（O2PLS-DA），最終通過方差分析（Cross-Validate Residuals）和排 列檢 驗(yàn)（Permutation Test）來評估O2PLS-DA判別模型的穩(wěn)定性和有效性。基于O2PLS-DA判別模型成功建立前提下，通過選擇VIP值和P值來找出識別不同種類白茶的關(guān)鍵質(zhì)譜峰，同時(shí)進(jìn)行四種不同種類白茶的層次聚類分析（HCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶香氣成分分析

比對四種白茶對應(yīng)香氣質(zhì)譜峰的濃度，發(fā)現(xiàn)每個種類的白茶都有一些香氣組成含量與其他三個種類白茶有較明顯的區(qū)別。但如果只是用單一的變量（濃度）來區(qū)分不同種類的白茶，從查閱的文獻(xiàn)來看仍然沒有一個單一的變量可以清晰地區(qū)分所有的種類，所以基于單變量分析的判別模型并不適合不同種類白茶的識別。因此需要借助多變量分析方法即采用雙向正交偏最小二乘-判別分析（O2PLS-DA）判別模型來找出不同種類白茶之間香氣的差異性關(guān)鍵變量。

但在進(jìn)行建立雙向正交偏最小二乘-判別分析（O2PLS-DA）判別模型前，需要進(jìn)行主成分分析（PCA）判別。只有PCA能初步判別出不同種類白茶，才能進(jìn)行雙向正交偏最小二乘-判別分析（O2PLSDA）判別。

2.2 利用主成分分析（PCA）對茶葉種類進(jìn)行分類

利用PCA判別模型識別不同種類白茶中揮發(fā)性物質(zhì)的差異，PCA識別結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，白牡丹、壽眉、貢眉、白毫銀針明顯分為四個區(qū)域，說明不同種類的白茶釋放的揮發(fā)有機(jī)化合物的化學(xué)成分存在顯著差異。模型參數(shù)［R2X（cum）= 0.8927，Q2（cum）=0.8337］表明，前三個主成分總值（PCs）分別可以解釋和預(yù)測總變量的89.27%和83.37%。因此，主成分分析判別模型具有良好的解釋擬合性和較高的樣本識別精度。

圖1 PCA判別模型識別不同種類白茶情況

雖然主成分分析判別模型能判別不同種類白茶，但由于主成分分析是一種無監(jiān)督模型，它沒有各組成的信息，只會揭示對總變異性起主要作用的差異，如果嘗試找出每個主成分（PC）中貢獻(xiàn)度最大的變量，往往是低效的，而且很多時(shí)候會引進(jìn)實(shí)驗(yàn)者在甄別關(guān)鍵變量時(shí)候的主觀偏見，就不能保證結(jié)果的客觀性，因此在無監(jiān)督PCA能初步判別出不同種類白茶前提下，有監(jiān)督的雙向正交偏最小二乘-判別分析（O2PLS-DA）判別模型被應(yīng)用于進(jìn)一步的判別分析。

2.3 利用O2PLS-DA判別茶葉種類

利用O2PLS-DA判別模型識別不同種類白茶中揮發(fā)性物質(zhì)的差異，OPLS-DA識別結(jié)果見圖2。模型參數(shù)［R2Y（cum）=0.9477，Q2（cum）=0.8065］表明，可以解釋和預(yù)測總變量的92.59%和92.01%。模型P值經(jīng)CV-ANOVA顯著性檢驗(yàn)為0.00071，說明模型組間有顯著性差異（pCV-ANOVA＜0.05）。200次排列實(shí)驗(yàn)（圖3）表明模型穩(wěn)定有效（R2=0.455，Q2=-0.730）。

圖2 O2PLS-DA判別模型識別不同種類白茶情況

圖3 200次排列試驗(yàn)結(jié)果

在O2PLS-DA識別模型中，VIP值大于1表明這些變量是重要的。因此結(jié)合VIP ＞ 1和 P ＜ 0.05選出作為O2PLS-DA模型識別不同種類白茶的關(guān)鍵質(zhì)譜峰：m/z 89.0463（乙酸乙酯），m/z 103.0751（異戊酸），m/z 109.0658（苯甲醇），m/z 111.080 2［（E，E）-2，4-庚二烯醛］，m/z 117.0771（丁酸乙酯），m/z 131.1066（庚酸），m/z 143.1433（壬醛），m/z 155.1433（芳樟醇），因此這8個質(zhì)譜峰是識別白茶種類的關(guān)鍵變量。

2.4 四種不同種類白茶的層次聚類分析（HCA）

為了觀察四種不同種類的白茶揮發(fā)性香氣組分聚類分析，進(jìn)行了層次聚類分析（HCA）。HCA結(jié)果表明，樣品按種類聚類，白牡丹樣品和白毫銀針樣品形成聚類，然后與貢眉樣品聚類，最后與壽眉樣品聚類（圖4）。因此，HCA結(jié)果與O2PLS-DA一致。

圖4 不同種類白茶的層次聚類分析（HCA）結(jié)果

3 結(jié)語

本研究建立了不同種類的白茶O2PLS-DA判別模型。并通過方差分析（Cross-Validate Residuals）和排列檢驗(yàn)（Permutation Test）來驗(yàn)證O2PLS-DA模型的穩(wěn)定性和有效性。通過選擇VIP值和P值來找出識別不同種類白茶的關(guān)鍵質(zhì)譜峰（m/z 89.0463（乙酸乙酯），m/z 103.0751（異戊酸），m/z 109.0658（苯甲醇），m/z111.0802［（E，E）-2，4-庚二烯醛］，m/z 117.0771（丁酸乙酯），m/z 131.1066（庚酸），m/z 143.1433（壬醛），m/z 155.1433（芳樟醇），同時(shí)層次聚類分析（HCA）與O2PLS-DA結(jié)果一致。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明O2PLS-DA判別模型可以為建陽白茶的不同種類鑒定提供參考，也為白茶種類識別提供一定的技術(shù)支持。