基于2019-nCoV 3CL Mpro篩選祛肺毒一號方的活性成分及其治療COVID-19的分子機制*

孫潔，蔣士卿

1.焦作市婦幼保健院，河南 焦作 454000； 2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)，簡稱“新冠肺炎”，是由一種新型冠狀病毒導致的嚴重傳染性疾病，目前正在全球范圍內暴發。從臨床情況來看，該疾病具有傳播速度快、傳染性強、無特定易感人群等特點，且無特效藥物可用。在臨床治療過程中，西醫主要以對癥支持治療為主，針對高熱、咳嗽、肺部CT異常、氧飽和率低、甚至呼吸困難等癥狀，做出維持水、電解質與酸堿平衡，氧療與呼吸支持，抗病毒，抗細菌的治療等。中醫認為新冠肺炎是疫毒閉肺證，病因主要是感受疫癘之氣和正氣虧虛兩方面，表現為高熱、或身熱不退或往來寒熱，咳嗽痰少、或有黃痰，煩躁，胸憋悶，氣促，舌質紅或紫暗，舌苔黃燥，脈滑數。中醫藥在治療COVID-19時具有一定優勢，尤其是在救治危重型患者方面，大大提高了患者的好轉率、治愈率，改善了重型、危重型患者預后較差的狀況。祛肺毒一號方(生曬參30 g，荊芥15 g，金銀花 15 g，玄參15 g，連翹30 g，皂角刺 10 g，杏仁 10 g，露蜂房10 g，甘草6 g)具有補氣養陰、清熱解毒、止咳祛痰平喘的功效，在定點醫院收治的重型/危重型新冠肺炎患者中取得了良好的臨床治療效果[1]，但由于該方的活性物質基礎和作用機制尚未明確，使其在抗新冠病毒使用和推廣等方面都受到了一定的限制。

分子對接技術利用計算機模擬藥物分子與蛋白質相互作用的結合過程，預測藥物分子和靶點的結合方式和親和力，可用于藥物的分子機制研究[2]。新冠肺炎病毒是一種正鏈病毒，RNA直接附著于宿主細胞核糖體上，翻譯出大分子蛋白，并迅速被蛋白水解酶降解[3]。2019-nCoV 冠狀病毒3CL水解酶(2019-nCoV 3CL Mpro)常被認為是理想的抗SARS-CoV藥物篩選靶標[4]。因此，本研究以 2019-nCoV 3CL Mpro作為抗新冠肺炎病毒的靶蛋白進行祛肺毒一號方成分的篩選，并利用網絡藥理學從分子水平探究了祛肺毒一號方治療新冠肺炎的物質基礎和作用機制，旨在為中醫藥治療新冠肺炎的研究和祛病毒一號方的臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 小分子數據庫的建立祛肺毒一號方由生曬參、荊芥、金銀花、玄參、連翹、皂角刺、杏仁、露蜂房、甘草9味中藥組成。采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)檢索祛肺毒一號方組方中藥的化學成分。露蜂房的化學成分未在TCMSP數據庫中檢索到，故通過查閱文獻[5-7]進行搜集。以類藥性(drug likeness，DL)≥0.18及口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%為標準進行篩選，將所得的化學成分建立小分子數據庫。

1.2 分子對接及驗證采用Chem 3D軟件構建小分子數據庫中化學成分的三維分子結構，并利用MM2分子力學方法優化。從結構生物信息學研究合作實驗室蛋白質數據庫(research collaboratory for structural bioinformatics protein data bank，RCSB PDB，http：//www.rcsb.org)中下載2019-nCoV 3CL Mpro的三維結構，利用Autodocktools 1.5.6工具刪除晶體中的結晶水，并為蛋白添加氫原子和gasteiger電荷。采用AutoDock 4.2程序進行分子對接[8]，評價祛肺毒一號方中的化學成分與2019-nCoV 3CL Mpro的結合活性。對接的活性位點參數如下：盒子坐標為(-9.732，11.403，68.639)，盒子三維的格點數為(40，55，40)，采用拉馬克遺傳算法，其他參數采用默認設置。為了驗證autodock程序對本研究體系對接的可靠性，將靶蛋白復合物6LU7的原有配體抽離，再重新對接到靶蛋白的活性口袋，并計算對接后配體的構象與原始晶體結構中配體構象的均方根偏差值(root-mean-square deviation，RMSD)。一般認為當RMSD值≤2.0?時，該對接方法可以較好地重現配體受體原來的結合模式，表明對接參數設置合理[9]。

1.3 “活性成分-疾病”交集靶點篩選以 -9 kcal·mol-1為篩選標準對對接的化合物進行篩選，并將篩選出的化合物導入SwissTargetPrediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)數據庫[10]預測化合物的作用靶點。以“novel coronavirus”為關鍵詞，在人類基因數據庫(the human gene database，GeneCards，https：//www.genecards.org/)[11]、美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information，NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫[12]以及CTD(http：//ctdbase.org/)數據庫[13]進行疾病相關靶點檢索。其中CTD的數據以“inference score”進行中位值篩選以獲得相關性更強的靶點。將篩選出的藥物靶點與疾病靶點輸入韋恩圖制作軟件venny 2.1，交集靶點即為藥物作用于疾病的靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(protein - protein interaction，PPI)網絡構建蛋白質-蛋白質相互作用是認識生命活動基本規律、探索疾病發生發展和防治的重要途徑。將活性成分作用于疾病的靶點導入STRING 11.0(https：//string-db.org/)數據庫[14]，將生物種類設定為“Homo sapiens”，設置可信度>0.9，最終獲得蛋白質相互作用網絡圖。采用拓撲分析和聚類分析篩選得到關鍵靶點及核心基因。

1.5 富集分析將藥物作用于疾病的靶點基因導入DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數據庫，進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析，將富集結果導入Omi share Tools(http：//www.omicshare.com/tools/index.php/)繪制對應的柱形圖及高級氣泡圖。

1.6 “中藥活性成分—疾病—通路—靶點”網絡構建將祛肺毒一號方治療COVID-19的靶點與活性成分進行映射關聯，得到“活性成分-靶點”關聯表，與PPI網絡共同導入Cytoscape3.7.2軟件，構建“中藥活性成分-疾病-通路-靶點”網絡。

2 結果

2.1 祛肺毒一號方化學成分的篩選通過檢索 TCMSP 數據庫與文獻查找篩選出祛肺毒一號方的化學成分，其中人參22個、荊芥11個、金銀花23個、玄參9個、連翹23 個、皂角刺11個、杏仁19個、露蜂房53個、甘草92個，刪除重復及未報道結構的成分，最終得到220個化合物。

2.2 分子對接方法可靠性驗證靶蛋白(PDB ID：6LU7)是2019-nCoV 3CL Mpro和化合物N3的復合物[15]，兩者的結合能ΔGbinding=-9.40 kcal·mol-1。將靶蛋白原始晶體結構中配體構象與對接后配體的構象疊合可以明顯看出，對接后的配體構象與原始晶體結構中的配體構象基本重合，且N3對接前后的RMSD值均為0.82?，表明本對接方法及對接參數設置合理，可信度高。見圖1。

注：圖中玫紅色為靶點蛋白(飄帶模型)；金色為原始配體；藍色為對接后的配體

2.3 祛肺毒一號方活性成分篩選當ΔGbinding<0時，表明配體分子與受體分子可以自發結合，ΔGbinding越低，則配體和受體的結合越穩定。按照ΔGbinding≤-6 kcal·mol-1、-7 kcal·mol-1、-8 kcal·mol-1、-9 kcal·mol-1的標準分析對接結果發現，祛肺毒一號方的220種化學成分的占比分別為84.6%、73.35%、48.8%、15.1%，其中人參、連翹及露蜂房中具有較低結合能的化學成分占比較高。以ΔGbinding≤-9 kcal·mol-1為標準篩選得到33個活性成分，且與2019-nCoV 3CL Mpro結合能較低的前5位成分分別是化合物109：(2S)-2-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-8，8-dimethyl-2，3-dihydropyrano[2，3-f]chromen-4-one；化合物78：xambioona；化合物26：菠菜甾醇；化合物141：3，22-dihydroxy-11-oxo-delta(12)-oleanene-27-alpha-methoxycarbonyl-29-oic acid；化合物110：euchrenone。這些化合物與靶蛋白的關鍵氨基酸殘基不但能夠形成氫鍵，還能形成疏水等作用，占據靶蛋白的活性位點，使靶蛋白2019-nCoV 3CL Mpro失活。見表1，圖2。

表1 祛肺毒一號方中篩選出的33個活性成分

注：表示疏水相互作用；----表示氫鍵作用；A：化合物109；B：化合物26；C：化合物141；D：化合物178；E：化合物110

2.4 多配體—單靶點對接中藥成分復雜，在治療疾病的過程中，往往可以通過多途徑、多靶點協同發揮作用[16]。中藥多成分多靶點協同作用網絡中存在多成分單靶點疊加作用，可實現中藥的科學配伍，提高療效[17]。為了驗證祛肺毒一號方中是否存在多成分同時作用，選擇結合能最低的3個化合物依次對接到靶蛋白2019-nCoV 3CL Mpro的活性口袋，結果發現3個化合物不僅可以與靶蛋白直接建立相互作用，且3個化合物之間存在π-σ和π-π相互作用，使3個化合物形成穩定的體系，共同作用于靶蛋白，即化合物109先進入靶蛋白的活性口袋，與氨基酸His41、Cys145、His163、His172、Met165、Leu167、Met165、Pro168形成相互作用，之后化合物178進入活性口袋內部，不僅與氨基酸殘基Ser46之間形成了氫鍵，且與化合物109之間形成了π-π等相互作用；化合物26進入活性口袋后，基本占據了活性口袋出口。3個化合物協同作用，靶蛋白活性口袋的關鍵氨基酸位點被完全占據，有效抑制了靶蛋白的活性。見圖3，表2。

注：(a)3個活性成分與靶蛋白2019-nCoV 3CL Mpro的結合圖；(b)、(c)、(d)分別為化合物109、178、26與靶蛋白2019-nCoV 3CL Mpro的相互作用模式圖

表2 3個活性成分與靶蛋白2019-nCoV 3CL Mpro結合的ΔGbinding結果

2.5 祛肺毒一號方治療COVID-19的作用靶點將祛肺毒一號方的33個活性成分導入SwissTargetPrediction數據庫，篩選得到活性成分的作用靶點728個。采用GeneCards、NCBI、CTD三個數據庫檢索并搜集COVID-19疾病相關靶點分別791個、136個、3 593個，合并刪重后得到COVID-19疾病相關靶點 4 165 個。將33個祛肺毒一號方活性成分的728個靶點與4 165個COVID-19疾病相關靶點進行映射，最終得到祛肺毒一號方治療COVID-19的有效靶點347個。見圖4。

圖4 祛肺毒一號方活性成分靶點與COVID-19疾病靶點韋恩圖

2.6 蛋白質相互作用網絡將祛肺毒一號方治療COVID-19的347個靶點導入STRING數據庫，得到PPI網絡，該網絡中有347個節點，1 780條邊，平均度值為10.3。導入Cystoscape 3.7.2軟件繪制PPI網絡圖，圖中節點顏色和大小根據度值調整，面積越大，顏色越深，則度值越大，線條從粗到細表示邊介數從大到小。采用NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，以度值(degree)、中介中心性(betweenness centrality)、平均最短路徑長度(average shortest path length)和緊密中心性(closeness centrality)4個參數為參考標準，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶點，總共篩選出114個關鍵靶點，使用R 3.6.3軟件繪制出前20個靶點。通過MCODE模塊[18]進行基因簇的分析及核心靶點的篩選，共得到12個基因簇和11個核心基因，核心基因為CCR1、HCRTR2、MAPK3、BCL2L1、IKBKB、CYP1A2、CDK5、CCNA1、PPARG、PLAU、FLT1。見圖5、圖6，表3。

表3 12個基因簇的詳細信息表

圖5 PPI網絡圖

注：橫坐標為靶點的degree值；縱坐標為靶點

2.7 GO富集分析與KEGG通路富集分析將347個祛肺毒一號方治療COVID-19的有效靶點導入DAVID數據庫進行GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析，以P≤0.05為標準進行篩選，共富集到GO生物功能3 210條，KEGG信號通路179條。3 210條GO生物功能包括2 871條生物過程(biological process，BP)、230條分子功能(molecular function，MF)及109條細胞組分 (cell component，CC)，分子功能主要涉及絲氨酸蛋白酶激酶活性、 酪氨酸激酶活性、 磷酸酶活性 、磷酸酶結合核受體等受體的活性；生物過程主要涉及氧化應激反應、細胞對藥物的反應、肽基絲氨酸修飾等；細胞組分主要涉及膜筏、膜微疇、膜區等。選取179條信號通路中排名前20的通路進行分析發現，靶點顯著富集于磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、 缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號通路、糖尿病并發癥中的糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGE)-AGE受體(receptor for AGE，RAGE)信號通路、T細胞受體信號通路、愛潑斯坦-巴爾病毒感染等通路。見圖7、圖8。

圖7 關鍵靶點的GO富集分析

圖8 關鍵靶點的 KEGG通路富集

2.8 “中藥活性成分-疾病-通路-靶點”網絡構建采用Cytoscape3.7.2軟件進行通路網絡圖的繪制，以便更直觀地展示中藥活性成分在治療COVID-19過程中多成分、多靶點的作用特點。見圖9。

注：藍色為活性成分；黃色為活性成分作用于疾病的靶點；綠色為最顯著的前20條通路；紅色為疾病，即COVID-19

3 討論

新冠肺炎屬于中醫疫毒閉肺證，是正虛邪實的表現。從中醫角度分析，祛肺毒一號方以大補元氣的人參與玄參共同作用達到補氣養陰的功效，以金銀花、連翹、荊芥、皂角刺協同使用使清熱解毒能力尤佳，杏仁止咳祛痰平喘，露蜂房攻毒殺蟲、祛風，甘草調和諸藥。現代藥理研究表明，人參中的活性物質具有提高免疫、抗病毒的作用，同時對呼吸道病毒有抑制作用[19]；金銀花具有抗病毒，治療感染及各種炎癥的藥理作用[20-21]；連翹具有清除內毒素、抗炎、增強免疫等藥理作用[22]；荊芥具有抗病毒、解熱鎮痛、抗炎的功效[23]；皂角刺可治療浸潤型肺炎，還具有抗病毒、調節免疫力的作用[24-26]；杏仁具有抗肺纖維化、抗高氧誘導肺損傷、免疫調節、抗腫瘤、抗炎的功效[27]；露蜂房有抗炎、抗菌抗病毒及防治肺纖維化和解熱鎮痛的作用[28]；甘草具有抗炎及免疫抑制作用，同時具有解毒、抗病毒、鎮咳祛痰、抑菌、抑制氣道平滑肌細胞增生的作用[29]。

通過分子對接篩選結果表明，在祛肺毒一號方中有220種活性成分符合OB≥30%且DL≥0.18的篩選標準，其中ΔGbinding≤-6 kcal·mol-1的活性成分達到總成分的84.6%；ΔGbinding≤-7 kcal·mol-1的活性成分達到總成分的73.35%；ΔGbinding≤-8 kcal·mol-1的活性成分達到總成分的48.8%；ΔGbinding≤-9 kcal·mol-1的活性成分達到總成分的15.1%，共33個。通過網絡藥理學分析發現PIK3R1、Akt、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、MAPK3可能是核心靶點。網絡拓撲分析顯示，祛肺毒一號方治療 COVID-19的過程中涉及多種生物過程、細胞組分和分子功能，且核心靶點顯著富集于PI3K-Akt信號通路、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、HIF-1信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、T細胞受體信號通路、愛潑斯坦-巴爾病毒感染通路等多個通路。PI3K是肺細胞重要的調節酶之一，影響肺組織的生理和病理變化[30]。研究發現，PI3K不僅可以影響細胞內的酪氨酸激酶、絲/蘇氨酸激酶的活性從而調控細胞的生物過程，而且在造成急性肺損傷的過程中起著不可忽視的作用[31]，進而導致COVID-19引起急性肺損傷時炎癥因子的浸潤。MAPK在炎癥反應中發揮重要作用，MAPK1、MAPK3兩種激酶激活可調節細胞的生長、分化、應激、炎癥反應等病理效應[32]，從而加劇炎癥反應。冠狀病毒的入侵激活了人巨細胞病毒感染通路，影響磷酸酶活性和磷酸酶結合核受體活性，進入T細胞受體信號通路，逃脫PD-1/ PD-L1檢查點的檢查，加速了全身免疫系統的損傷。因此推測新冠病毒可能是通過入侵人體，刺激免疫反應，啟動 PI3K-Akt信號通路途徑，促進MAPK1、MAPK3等激酶的表達，導致肺部炎性反應，引起急性肺損傷；而祛肺毒一號方可能通過調節 PI3K-Akt等信號通路起到治療 COVID-19的效果。

通過單配體-單靶點的對接，發現祛肺毒一號方中化合物109、178、26、141、110對2019-nCoV 3CL Mpro有較強的疏水相互作用，可占據蛋白的活性位點，抑制蛋白發揮作用，是祛肺毒一號方發揮療效的關鍵成分。通過多配體-單靶點的對接發現，化合物109、178、26與2019-nCoV 3CL Mpro都有很強的結合力，導致2019-nCoV 3CL Mpro失活，提示這3種成分可直接有效的發揮抗病毒作用，且3種成分可在2019- nCoV 3CL Mpro的活性位點協同作用，共同抑制水解酶的活性，發揮抑制病毒的作用。

本研究首先采用分子對接方法篩選出祛肺毒一號方對2019-nCoV 3CL Mpro有明顯抑制作用的活性成分，之后利用網絡藥理學方法進一步研究了祛肺毒一號方治療COVID-19的作用機制。該研究的預測結果與相關文獻[19-32]結果一致，說明本研究方法可靠，結果可信，為后續研究提供了一定的參考。