基于指紋圖譜結合化學模式識別法評價不同浸漬時間炎痛止塌漬液的質量*

李瑩瑩，楊春靜，雷敬衛，賈豪，張維方，龔海燕，紀亮

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046； 2.河南省中藥質量控制與評價工程技術研究中心，河南 鄭州 450046； 3.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450000

膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床常見的慢性退行性骨關節疾病，多發于中老年人群[1-2]。中醫認為該病屬“骨痹”范疇，《素問·痹論》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹”，即風寒濕入侵膝關節，導致氣血不通，經絡痹阻，久之引發疼痛、關節僵硬、腫脹積液[3]，臨床治療常以活血化瘀、通絡止痛為主[4-6]。中藥塌漬療法最早見于《五十二病方》，通過中藥煎湯外敷治療疾病。《黃帝內經》有云“其有邪者，漬形以為汗”，元代《外科精義》載“溻漬法，瘡瘍在四肢者，溻漬之。疏導腠理，通調血脈，使無凝滯也”。傳統中藥塌漬方法是用6～8層紗布浸透藥液做為藥墊直接濕敷于患處結合特定電磁波治療器照射患處的一種外治法[7-8]。中藥外用塌漬液有其獨特優勢，臨床研究表明，采用中藥塌漬液治療老年KOA的總有效率顯著高于對照組[9]；實驗研究表明，活血痛痹湯塌漬液可通過下調下游基因MMP3、MMP13、BMP2等的表達治療兔KOA[10]。目前，中藥塌漬液治療KOA已廣泛用于臨床。炎痛止(yantongzhi，YTZ)塌漬液是河南中醫藥大學第三附屬醫院自擬處方，由紅花、川芎、三七、血竭、透骨草、伸筋草、杜仲、制乳香、制沒藥、蜈蚣、狗脊、地龍、冰片、自然銅14味藥物組成，用于住院期KOA患者的治療。處方采用冷浸法，將上述中藥材混勻，置容器內輔以70%乙醇密閉，浸漬15～30 d 濾過，塌漬患處[11]。

中醫藥現代化趨勢要求確定中醫藥自我主體的前提下，以科學技術為依托，吸收利用現代科學技術成果，建立嚴謹的方法學體系，形成科學模式，從而建立中醫藥學自身標準系統[12-13]。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)是一種綜合的、可量化的分析評價方法[14]，化學計量學方法可對大量數據進行模式識別并分析量化[15]，兩者相結合是目前相對完整評價藥材質量整體性的方法，也是現代科學技術手段同傳統中醫療法相結合的有效研究方法。目前，有學者利用高效液相聯用質譜技術建立三七藥酒、馮了性風濕跌打藥酒的指紋圖譜[16-17]。現今對于塌漬液成分研究較少，臨床應用中對其具體浸漬時間僅有經驗值，而不同浸漬時間下塌漬液內在成分是否一致，何為發揮藥效的主要成分仍不清楚。基于此，本研究采集YTZ不同浸漬時間塌漬液的HPLC指紋圖譜，結合模式識別方法(相似度評價、灰色關聯度分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析)對其進行評價，旨在探討YTZ浸漬過程中的動態信息及不同浸漬時間的整體化學組分差異，為研究YTZ塌漬液物質基礎及浸漬平衡點提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；101-3AB型電熱鼓風干燥箱、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋、FW-100型高速多功能粉碎機(北京中興偉業儀器有限公司)；HQ-700DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；四號藥典篩(浙江上虞市五四儀器篩具廠)；BSA224S-CW型萬分之一天平、CPA225D型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)。

1.2 材料羥基紅花黃色素A對照品(純度≥98.11%)、川芎嗪對照品(純度≥99.95%)、人參皂苷Rg1對照品(純度≥99.44%)(成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-20080111、MUST-19051403、MUST-19022811)；血竭素高氯酸鹽對照品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：Y17M97H56341)；甲醇(色譜純，美國Tedia公司，批號：MS1922-801)。本實驗所用飲片由河南中醫藥大學第三附屬醫院中藥房提供，經河南中醫藥大學陳隨清教授鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 YTZ塌漬液HPLC指紋圖譜

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取適量羥基紅花黃色素A、川芎嗪、人參皂苷Rg1及血竭素高氯酸鹽對照品至5 mL容量瓶中，加入甲醇定容至5 mL，即得混合對照品溶液。

2.1.2 樣品制備根據處方稱取紅花、川芎、三七、血竭、透骨草、伸筋草、杜仲、制乳香、制沒藥、蜈蚣、狗脊、地龍、木瓜、冰片和自然銅粗粉各三份，分別置于廣口瓶中，編號為1、2、3。加入處方藥材8倍量的70%乙醇，取浸漬1～50天的塌漬液。將三個瓶子中1～50 d塌漬液樣品編號為1-1、1-2…1-50，2-1、2-2…2-50，3-1、3-2…3-50。

2.1.3 供試品溶液制備取25 mL樣品溶液，并補足廣口瓶內減失體積，過濾后精密吸取20 mL續濾液置65 ℃水浴得恒重浸膏，30%甲醇溶解，轉移至 5 mL 容量瓶中，加入30%甲醇定容至5 mL，過 0.45 μm 微孔濾膜即得。

2.1.4 色譜條件Venusil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)；梯度洗脫(0～15 min，5%～10%A；15～20 min，10%～16%A；20～40 min，16%～31.5%A；40～50 min，31.5%～32%A；50～60 min，32%～34%A；60～75 min，34%～37%A；75～90 min，37%～41%A；90～100 min，42%A；100～110 min，42%～44%A；110～120 min，44%～48%A；120～130 min，48%～51%A；130～135 min，51%～52%A；135～145 min，52%～100%A；145～150 min，100%A)；流速 1 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；檢測波長203 nm。

2.1.5 方法學考察精密度試驗：精密量取1-40塌漬液樣品1份，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1.4項下色譜條件連續進樣6次，以川芎嗪為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值為0.00%～0.79%，相對峰面積RSD值為0.00%～1.87%，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密量取1-40塌漬液樣品6份，按2.1.3項下方法平行制備供試品溶液6份，按照2.1.4項下色譜條件進樣，以川芎嗪為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD值為0.00%～1.31%，相對峰面積RSD為0.00%～2.90%，表明實驗重復性良好。

穩定性試驗：精密量取1-40塌漬液樣品1份，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h按2.1.4項下的色譜條件進樣，以川芎嗪為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD值為0.00%～0.85%，相對峰面積RSD為0.00%～1.93%，表明供試品溶液穩定性良好。

2.1.6 YTZ塌漬液指紋圖譜的建立及相似度評價取YTZ供試品溶液，按照2.1.4項下色譜條件進樣，采集HPLC指紋圖譜。應用中藥色譜指紋圖譜評價軟件(2004A)對YTZ塌漬液供試品溶液的HPLC指紋圖譜進行分析，采用中位數法將3份第 1～50天塌漬液的HPLC指紋圖譜生成HPLC疊加圖譜S1～S50。將S1～S50圖譜導入相似度評價軟件，設定時間窗寬度為0.3，采用中位數法，經全譜峰匹配后生成對照圖譜，對照圖譜相似度結果為0.428～0.747。該相似度結果低，可能是由于不同浸漬時間的YTZ塌漬液差異較大。以相似度結果為篩選條件，對S1～S50的指紋圖譜進行篩選，經篩選后S1～S50圖譜分為兩組，S1～S26相似度為0.922～0.991，S27～S50相似度為0.944～0.994。兩組樣品均標定11個共有峰，其中峰1為羥基紅花黃色素A，峰4為川芎嗪，峰10為人參皂苷Rg1，峰11為血竭素高氯酸鹽，且川芎嗪(峰4)的重復性和分離度都較好。見圖1。

圖1 不同浸漬時間YTZ塌漬液疊加指紋圖譜及對照圖譜

2.2 灰色關聯度分析

2.2.1 原始數據的規格化處理基于50份HPLC指紋圖譜中的11個共有峰面積，建立不同時間YTZ質量灰色模式識別數據集，由于其量綱不統一，對原始數據進行規格化處理，采用均值化處理，使規格化后的數據具有可比性。設有a個樣品，每個樣本有b項評價指標，組成評價單元序列{Xtk}(t= 1，2，3…a；k= 1，2，3…b；本實驗中 a=50，b=11)，按公式1對不同時間YTZ指紋圖譜數據進行規格化處理。式中，Ytk為規格化處理后的數據，Xtk為原始數據，Xk為a個樣品第k個指標的均值。

2.2.2 參考序列的選擇采用灰色關聯度為綜合評價指標時需要確定參考序列，即需要選出最優參考序列和最差參考序列，最優參考序列{YLk} (k= 1，2，3…b)，是a個樣品中各項對應指標的最大值，最差參考序列{Ysk} (k= 1，2，3…b)，為a個樣品中各項對應指標的最小值。

2.2.3 關聯度計算關聯度是指對于兩個數據列間的因素，隨時間或不同對象而變化的關聯性大小的量度。不同數據組間相對關聯度大、分布范圍密集表明分布質量更優。

根據公式依次計算出不同浸漬時間樣品的相對關聯度，并按照ri大小排序。由灰色關聯度分析計算結果，根據50 d樣品的11個共有峰峰面積數據的分析，浸漬1～26 d及27～50 d的相對關聯度范圍分別是0.278 3～0.502 2和0.468 2～0.659 4，表明浸漬27 d后塌漬液的質量明顯優于浸漬前 26 d 的塌漬液質量。見表1。

表1 不同浸漬時間YTZ塌漬液的相對關聯度

2.3 聚類分析以不同浸漬時間YTZ塌漬液的11個共有峰峰面積為原始數據，采用SPSS 19.0軟件對數據進行系統聚類分析，采用Ward法，以平方Euclidean距離為分類依據，當平方Euclidean距離為5時，塌漬液樣品被分為4類，浸漬6～26 d、1～5 d、42～50 d、27～41 d分別聚為一類，表明浸漬時間對YTZ塌漬液內在質量存在影響；當平方Euclidean距離為14時，塌漬液樣品被分為3類，1～26 d、42～50 d、27～41 d分別聚為一類，表明浸漬42～50 d，27～41 d塌漬液與浸漬前26 d存在一定差異；當平方Euclidean距離為20時，塌漬液樣品聚為兩大類，1～26 d、27～50 d聚為兩類，表明兩個樣品組之間存在明顯差異。見圖2。

圖2 YTZ不同浸漬時間塌漬液聚類分析樹狀圖

2.4 主成分分析以不同浸漬時間YTZ塌漬液11個共有峰峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件對數據進行降維因子分析，抽樣適合性檢驗(kaiser-meyer-olkin，KMO)統計量為0.805>0.7，巴特利球體(bartlett)檢驗統計量為0.000，表明各因子間關聯性好，適合主成分分析。以特征值>1為標準，提取出2個主成分，二者的方差貢獻率分別為52.394%和17.182%，累計方差貢獻率為69.576%>60%，表明該分析能比較全面地表征其化學成分特征。根據方差貢獻率，計算不同浸漬時間塌漬液的綜合得分。見表2、表3。

表2 主成分分析方差貢獻率

表3 不同浸漬時間YTZ塌漬液的綜合得分

2.5 正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)以不同浸漬時間YTZ塌漬液11個共有峰峰面積為變量，運用SIMCA-P 14.1軟件，采用有監督模式的OPLS-DA對樣品進行分析發現，不同浸漬時間樣品可明顯區分開，與聚類分析和主成分分析結果基本一致，表明不同浸漬時間樣品內部化學特征信息存在明顯差異。對變量重要性投影值(variable importance in the project，VIP)參數進行分析，篩選出對樣品分類貢獻較大的成分。VIP<1時，表明該變量對模型貢獻度較低；VIP>1表示該變量對整體模型的貢獻度高于平均水平，其中VIP>1的峰為峰1(羥基紅花黃色素A)、峰11(血竭素高氯酸鹽)、峰4(川芎嗪)、峰10(人參皂苷Rg1)，提示這4種成分在區分不同浸漬時間的YTZ塌漬液中起到重要作用，是產生差異的主要標志性成分。見圖3、圖4。

圖3 OPLS-DA散點得分圖

圖4 VIP得分圖

3 討論

前期實驗發現在不同體積分數的甲醇、乙醇作為復溶溶劑，不同流動相(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水)，不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，不同波長(203 nm、210 nm、230 nm、280 nm、310 nm)，不同體積流速(0.8 mL·min-1、1 mL·min-1)，不同進樣量(10 μL、20 μL) 條件下檢測時，以甲醇-水為流動相，在柱溫25 ℃、波長203 nm、流速1 mL·min-1、進樣量20 μL條件下檢測出現的色譜峰分離度好，基線平穩，響應值較好。

中藥塌漬液質量與其內在化學成分種類及含量相關。本研究所建立的HPLC指紋圖譜可反映其中多數具有紫外吸收的化學成分信息，對不同浸漬時間YTZ塌漬液指紋圖譜分析時發現，浸漬1～26 d，27～50 d YTZ指紋圖譜相似度均大于0.9，表明浸漬1～26 d時塌漬液成分差異不大，且浸漬 27～50 d YTZ塌漬液成分差異不大，而浸漬1～50 d的YTZ塌漬液的相似度在0.428～0.747間，表明 1～50 d YTZ塌漬液成分差異較大。以11個共有峰的峰面積為指標，進行灰色關聯度分析、主成分分析發現浸漬27～50 d的塌漬液質量優于1～26 d的塌漬液質量。聚類分析中1～26 d與27～50 d的YTZ塌漬液可明顯聚為兩大類。利用有監督下的 OPLS-DA分析篩選出區分不同浸漬時間YTZ塌漬液的主要標志性成分分別為羥基紅花黃色素A、血竭素高氯酸鹽、川芎嗪、人參皂苷Rg1。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)歸屬于紅花，是紅花活血化瘀的主要物質基礎。文獻報道HSYA可通過促進核仁素表達，調節血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)水平，進而促進血管新生[18-19]；血竭素高氯酸鹽歸屬于血竭，有活血、止血、鎮痛抗炎的作用[20]；川芎嗪歸屬于川芎，是川芎的特征性生物堿[21]，可上調 5-羥色胺受體達到鎮痛作用，還可抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)誘導的凝血作用，可能是川芎活血行氣及鎮痛的基礎物質[22-23]；人參皂苷Rg1歸屬于三七，是三七活血止血雙向作用的代表成分[24]，可抑制凝血酶誘導的血小板黏附和聚集[25]。本研究的指紋圖譜中所指認的四種成分可分別代表YTZ處方中紅花、血竭、川芎、三七的主要藥效成分，并在文獻中已證實其有活血化瘀、鎮痛消炎之效，結合模式識別分析可嘗試將這4種成分作為評價YTZ塌漬液質量優劣的重要指標。

中藥塌漬又稱為中藥蒸煮療法、藥透療法等，是中醫外治法中的一種，塌漬液濕敷達到消炎、鎮痛、止癢和抑制滲出等作用。塌漬液臨床療效確切，而在推廣使用過程中卻缺乏標準規范，如浸漬時間不定、物質基礎不明確等問題。本研究初步建立了YTZ塌漬液不同浸漬時間的HPLC指紋圖譜，可將其用于塌漬液浸漬過程的質量分析，而在研究過程中確定的4種差異性成分在YTZ塌漬液中如何發揮其活血化瘀、鎮痛消炎的藥效作用，有待進一步研究。