腸復方對腸癌荷瘤小鼠免疫調節作用的研究*

林宏遠，鄧湘琴，崔超宇，譚駿嵐，龍夢玲，宋程，梁慧

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208； 2.湖南省腫瘤醫院，湖南 長沙 410013

結直腸癌的發病呈上升趨勢，我國結直腸癌發病率在常見惡性腫瘤中為第4位，死亡率為第5位[1]。近年研究表明，結腸癌的發生、發展與免疫細胞、細胞因子等免疫介質的紊亂密切相關[2]。在結直腸癌腫瘤組織中浸潤了大量的免疫細胞，包括自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)、調節性T細胞(regulatory cells，Treg)等，同時分泌大量的免疫促進相關細胞因子和免疫抑制相關細胞因子參與結直腸癌免疫微環境的調控。在結直腸癌腫瘤免疫微環境中，NK細胞及免疫促進相關細胞因子白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)有利于維持正常的免疫功能，發揮抗腫瘤免疫作用，拮抗結直腸癌發生發展。Treg細胞及免疫抑制相關細胞因子 IL-10、轉化生長因子β(transforming growth factors-β，TGF-β)則引發免疫逃逸，抑制抗腫瘤免疫作用，促進了大腸癌的發生發展[3]。前期臨床研究證實，腸復方治療晚期大腸癌有效，可提高患者瘤體控制率，延長無疾病進展時間，提高遠期生存獲益[4]，提高晚期大腸癌患者外周血中NK細胞數量和CD4/CD8比值，改善患者的細胞免疫功能[5]。前期研究提示，在荷瘤小鼠瘤體和外周血中，腸復方對髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)有明顯的抑制作用，增加瘤體中CD4+、CD8+T細胞的水平，從而提高機體免疫狀態、抑制腫瘤發生[6]。基于此，為進一步探討腸復方的組方規律，本研究擬探索其不同治則發揮抗腫瘤作用及對腫瘤組織免疫微環境的影響。

1 材料

1.1 細胞及動物小鼠結腸癌細胞株CT26，購自中國醫學科學院細胞庫，編號ZQ0190。BALB/c小鼠，4～6周齡，50只(實驗動物合格證號：4300470059729；實驗動物使用編號：00190458)，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘) 2016-0002。在湖南省腫瘤醫院動物實驗中心SPF條件下飼養，予以自由飲食。本研究獲得中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院動物實驗倫理委員會批準，倫理批號：2019-18。

1.2 藥物及試劑香菇菌多糖片(湖北廣仁藥業有限公司，規格：10 mg/片，批號：1903010)；腸復方(黨參10 g，黃芪30 g，白術15 g，陳皮10 g，麥芽 15 g，雞內金15 g，薏苡仁30 g，香附15 g，郁金15 g，莪術15 g，土鱉蟲15 g，半枝蓮30 g，蛇舌草30 g，壁虎10 g，茯苓10 g，女貞子10 g，甘草5 g)、健脾益氣扶正(黨參10 g，白術15 g，茯苓10 g，黃芪30 g，女貞子10 g，雞內金15 g，麥芽15 g，甘草5 g)、祛濕化瘀解毒(陳皮10 g，薏苡仁30 g，香附15 g，郁金 15 g，莪術15 g，半枝蓮30 g，蛇舌草30 g，土鱉蟲 15 g，壁虎10 g)(以上中藥均購自湖南省腫瘤醫院中藥房)。RPMI 1640培養基(美國Sigma公司，批號：RNBH5043)；胰蛋白酶(上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0201)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10099-141)；青霉素鏈霉素混合液(上海碧云天生物技術有限公司，批號：SV30010)；MTT試劑(美國Sigma公司，批號：M2128)；IL-10抗體(美國Proteintech公司，批號：20850-1-AP)；TNF-α抗體(美國Proteintech公司，批號：60291-1-Ig)；IL-2 抗體(美國Proteintech公司，批號：26156-1-AP)；Foxp3抗體(英國Abcam公司，批號：ab215206)；TGF-β抗體(英國Abcam公司，批號：ab215715)；NK1.1抗體(美國eBioscience公司，批號：11-594-81)；40 ng·L-1多聚甲醛(上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0099)；二步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：PV-9000)；DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9018)。

1.3 儀器超凈工作臺(北京亞泰隆，型號：YT-CJ-2NB)；二氧化碳培養箱(上海三藤儀器，型號：DH-160I)；倒置生物顯微鏡(北京中顯恒業儀器，型號：DSZ2000X)；流式細胞分析儀(Beckman公司)；搖床(中國江蘇其林貝爾，型號：TS-92)；包埋機(常州中威電子儀器，型號：BMJ-A)；切片機(浙江金華益迪試驗器材，型號：YD-315)；蓋玻片、載玻片(海門遠泰公司，型號：DY89-1，AY89-2)；臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司，型號：TGL-18R)。

2 方法

2.1 藥物制備將購買的中藥經湖南省腫瘤醫院藥劑科鄒霞藥師鑒定后使用。溫水浸泡1 h，水量超出藥物3～5 cm，大火煮沸后轉小火煎30 min，趁熱過濾，藥渣按前法再煎煮2次，將3次藥液混勻、過濾，恒溫水浴箱上濃縮為扶正祛邪組濃度為3.6 g·mL-1、扶正組濃度為1.4 g·mL-1、祛邪組濃度為2.2 g·mL-1，4 ℃保存備用。

2.2 建模、動物分組及給藥方法常規復蘇CT26細胞，將細胞培養含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中；置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養并傳代。用0.25%胰蛋白酶消化收集對數生長期的細胞，使用PBS液配制成細胞密度為 1×107mL-1的單細胞懸液。取細胞濃度為1×107mL-1的CT26細胞懸液0.1 mL，即接種細胞數為1×106mL-1，分別注射到BALB/c小鼠的右腋下，建立小鼠結腸癌皮下移植瘤模型。按隨機數字表法將造模成功的50只小鼠隨機分模型組、扶正祛邪組、扶正組、祛邪組和香菇多糖組，每組10只。于造模后第7天皮下種植瘤生長至1 cm左右時開始干預，按 70 kg 人腸復方使用劑量給予小鼠相應等效劑量，扶正祛邪組按照每日使用劑量為36 g·kg-1灌胃給藥，扶正組每日使用劑量為14 g·kg-1、祛邪組每日使用劑量為22 g·kg-1，小鼠香菇菌多糖片使用劑量為 5.2 mg·kg-1，模型組給予蒸餾水。以上藥液每次灌胃0.2 mL，每天灌胃1次，每周5 d，連續干預4周。

2.3 對荷瘤小鼠的體質量及抑瘤率的影響常規每周測定各組小鼠體質量。干預結束后頸椎脫臼法處死小鼠，剝離腫瘤，稱重記錄，并計算各組藥物的抑瘤率。

抑瘤率(%)=(1-實驗組平均瘤質量/模型組平均瘤質量)×100%

2.4 流式檢測小鼠瘤體中NK細胞水平每組隨機選取5只小鼠，剝離瘤體組織，采用無菌眼科剪將瘤體組織剪碎，移液槍吹散，將含組織的懸液過200目細胞濾網，300 r·min-1離心 5 min得到沉淀，棄上清，PBS重懸收集細胞沉淀。每個瘤體細胞懸液樣本吸取1×106個細胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入的NK1.1流式抗體染色，避光孵育30 min，300 r·min-1離心5 min，棄上清后用PBS清洗2次，用1%多聚甲醛定容至300 μL，過350目濾網。4 ℃避光保存，流式上機檢測。

2.5 免疫組化檢測小鼠瘤體Treg、IL-10、TGF-β、IL-2、TNF-α的表達每組隨機選取5只小鼠，脫頸處死小鼠、剝離瘤體，石蠟固定包埋瘤體，間隔5 μm進行石蠟連續切片20張，每隔5張取一張表，插入固定，BSA封閉，分別滴加Treg、IL-10、TGF-β、IL-2、TNF-α抗體，4 ℃過夜，孵育二抗。DAB顯色，脫水，透明，封片，顯微鏡下陽性表達定位于細胞核，為棕黃褐色。顯微鏡下每張切片選擇3個視野，放大400倍下觀察視野中陽性細胞表達個數，取多個視野陽性細胞數。免疫組化染色圖像結果使用IPP(Image-Pro Plus 6.0)軟件進行分析。測量集成光密度及面積，用平均光密度評價Treg、IL-10、TGF-β、IL-2、TNF-α的表達水平。

平均光密度(IOD)=集成光密度/面積

3 結果

3.1 對腸癌荷瘤小鼠體質量的影響與模型組同期比較，治療第28天扶正祛邪組、扶正組、香菇多糖組小鼠體質量顯著升高(P<0.01，P<0.05)，而祛邪組小鼠體質量顯著降低(P<0.01)。與治療第0天比較，各組在治療后第28天，小鼠體質量均有不同程度地降低，其中模型組、祛邪組降低最為顯著(P<0.01)，香菇多糖組小鼠體質量亦有降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同治則對腸癌荷瘤小鼠體質量的影響

3.2 對腸癌荷瘤小鼠抑瘤率的影響與模型組比較，扶正組、香菇多糖組小鼠瘤質量顯著減輕(P<0.05)，抑瘤率顯著升高，扶正祛邪組、祛邪組小鼠瘤質量極顯著減輕(P<0.01)，抑瘤率極顯著升高。見表2。

表2 不同治則對腸癌荷瘤小鼠抑瘤率的影響

3.3 對腸癌荷瘤小鼠瘤體中NK細胞含量的影響通過流式細胞術檢測發現，與模型組比較，扶正祛邪組、扶正組、祛邪組瘤體中NK細胞的水平顯著升高(P<0.01)，香菇多糖組雖低于模型組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：A：模型組；B：扶正祛邪組；C：扶正組；D：祛邪組；E：香菇多糖組；與模型組比較，**P<0.01

3.4 對腸癌荷瘤小鼠瘤體Treg、IL-10、TGF-β的影響與模型組比較，扶正組、香菇多糖組小鼠瘤體中Treg、IL-10、TGF-β的水平顯著降低(P<0.05)，扶正祛邪組和祛邪組極顯著降低(P<0.01)；與香菇多糖組比較，扶正組小鼠瘤體中Treg、IL-10、TGF-β的水平均明顯降低(P<0.05)，扶正祛邪組和祛邪組顯著降低(P<0.01)；與扶正祛邪組比較，扶正組與祛邪組小鼠瘤體中Treg、IL-10、TGF-β的水平均顯著升高(P<0.01，P<0.05)。見圖2、圖3、圖4及表3。

注：A：模型組；B：扶正祛邪組；C：扶正組；D：祛邪組；E：香菇多糖組

注：A：模型組；B：扶正祛邪組；C：扶正組；D：祛邪組；E：香菇多糖組

注：A：模型組；B：扶正祛邪組；C：扶正組；D：祛邪組；E：香菇多糖組

表3 不同治則對荷瘤小鼠瘤體Treg、IL-10、TGF-β表達的影響 值)

3.5 對腸癌荷瘤小鼠瘤體IL-2、TNF-α表達的影響與模型組比較，祛邪組、香菇多糖組小鼠瘤體中IL-2、TNF-α表達水平顯著升高(P<0.05)，扶正祛邪組、扶正組極顯著升高(P<0.01)；與香菇多糖組比較，祛邪組小鼠瘤體中 IL-2、TNF-α表達水平顯著升高(P<0.05)，扶正祛邪組、扶正組極顯著升高(P<0.01)；與扶正祛邪組比較，扶正組小鼠瘤體中 IL-2、TNF-α表達水平顯著降低(P<0.05)，祛邪組極顯著降低(P<0.01)。見圖5、圖6及表4。

注：A：模型組；B：扶正祛邪組；C：扶正組；D：祛邪組；E：香菇多糖組

注：A：模型組；B：扶正祛邪組；C：扶正組；D：祛邪組；E：香菇多糖組

表4 不同治則對荷瘤小鼠瘤體IL-2、TNF-α表達的影響

4 討論

近年來，隨著民眾飲食結構的變化與癌癥篩查技術的進步，結直腸癌發病率呈逐步上升趨勢[7]。越來越多的證據表明，結直腸癌患者存在免疫抑制現象，現免疫治療成為繼手術、放療、化療后第四大治療方式。多項研究證實，中醫藥以其多靶點、增效減毒等優勢，在改善結直腸癌患者免疫功能方面取得了顯著的療效[8]。中醫并無“腸癌”這一病名，根據其臨床癥狀和體征，歸屬于“腸結”“癥瘕”等范疇，是多種病因共同作用下的結果。其發病為本虛標實，脾氣虧虛是大腸癌發病內在基礎，濕熱瘀毒為其發病重要條件，治療應以“抗癌解毒、扶正祛邪”為基本原則[9]。腸復方以“健脾益氣扶正、祛濕化瘀解毒”立法，在既往臨床應用和實驗研究中均證實腸復方對于結直腸癌的治療療效顯著。本研究進一步觀察不同組分對腫瘤生長、瘤體免疫細胞及免疫相關細胞因子的調控作用，分析不同治則在腸癌治療中所發揮的作用，進一步明確腸復方不同治則在免疫調控中的作用及其療效機制，為臨床配伍提供科學依據。

本研究發現腸復方健脾益氣扶正法偏重于穩定小鼠體質量，但對腸癌瘤體的抑制作用不明顯。祛濕化瘀解毒法偏重于抑制瘤體生長，但并不能穩定小鼠的體質量，反而使體質量下降。而健脾益氣扶正法和祛濕化瘀解毒法在穩定瘤體質量、控制瘤體生長方面均有明顯優勢。究其原因，脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾胃之氣健，則飲食攝納正常，氣血生化有源，推測健脾益氣扶正治法發揮了主要作用。研究證實，益氣健脾類中藥可有效改善大腸癌術后患者的免疫功能及胃腸功能，增強機體免疫能力，調節胃腸動力，進一步穩定體質量[10]。而活血化瘀中藥可通過抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞增殖、提高機體免疫力等直接抗腫瘤[11]，但化瘀解毒中藥寒涼、辛散，久用易損傷脾胃、耗散氣血，傷及正氣[12]，故祛濕化瘀解毒法的小鼠體質量下降明顯，但其抑制腫瘤生長的作用較優。扶正祛邪組荷瘤小鼠不但體質量穩定，而且抑瘤率高，全方配伍既能發揮抑瘤抗癌作用，又能發揮減輕化瘀解毒藥物傷正的副反應，發揮最大的治療效應。

結直腸癌的發生發展與腫瘤免疫微環境密切相關，腫瘤微環境是指腫瘤局部浸潤的免疫細胞、間質細胞及所分泌的活性介質等與腫瘤細胞共同構成的局部內環境[13]。研究顯示，腫瘤微環境中的免疫細胞及其分泌的細胞因子具有多種協助腫瘤發生發展的生物學行為，包括參與腫瘤局部血管生成、協助腫瘤細胞發生轉移及免疫逃逸等[14-18]。以Treg細胞及IL-10、IL-6、TGF-β等細胞因子促進了大腸癌的發生發展。Treg細胞是一類抑制免疫應答的Th細胞亞群，腫瘤細胞可利用Treg細胞實現免疫逃逸[19-20]。IL-10和TGF-β可誘導Treg分化，Treg細胞亦可通過釋放IL-10、TGF-β等免疫抑制相關細胞因子參與腫瘤細胞的免疫耐受和免疫抑制。TGF-β是NK細胞抗腫瘤應答的主要抑制因子之一，在多種腫瘤患者的瘤體中發現TGF-β的含量較正常人體高[21]。另一方面，在結直腸癌免疫微環境中，T細胞、NK細胞等細胞及其分泌的細胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α發揮抗腫瘤免疫作用，拮抗結直腸癌發生發展。NK細胞作為機體固有免疫的主要效應細胞，其殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，在腫瘤微環境中表達增高[22-23]。NK細胞可以調節核轉錄因子的活性，從而影響細胞因子的基因表達，抑制IL-2、TNF-α基因轉錄，從而調節免疫功能[24]。IL-2可促進T細胞增殖，刺激NK細胞生長，并增強其殺瘤活性，TNF-α不僅對多種腫瘤細胞在體外具有細胞毒作用，可通過對腫瘤細胞的直接殺傷作用來發揮抗腫瘤作用。中醫藥對于腫瘤免疫微環境的調節具有重要意義。研究發現，玉屏風散增強lewis肺癌小鼠中腫瘤浸潤的NK細胞，降低腫瘤微環境中NK免疫抑制相關細胞因子 TGF-β及 IL-10，進而增強NK細胞對腫瘤的殺傷活性[25]。同時免疫細胞分泌大量的細胞因子如IL-2、TNF-α、IL-10、TGF-β等參與結直腸癌免疫微環境的調控[26]。許榮忠等[27]發現祛邪治則和扶正祛邪治則均可調控肺癌患者的免疫功能，而祛邪治則在抑制MDSCs和Treg方面作用更強。研究發現，肝癌全方及其不同治法拆方通過改變細胞增殖和周期，從而發揮抑制肝癌的作用[28]。健脾消癌方含藥血清能抑制HCT116細胞遷移及侵襲，以健脾益氣為治則的健脾消癌方可能通過抑制Akt/mTOR信號通路的激活，從而抑制細胞增殖、侵襲遷移，發揮抗結腸癌及抗復發轉移作用[29]。本研究結果推測，腸復方不同組分可能通過上調NK細胞及IL-2、TNF-α，下調Treg及 IL-10、TGF-β的表達來實現免疫調節，從而抑制瘤體生長。

綜上所述，本研究發現，扶正祛邪組、扶正組小鼠瘤體中NK細胞及IL-2、TNF-α的表達水平顯著增加。腸復方扶正祛邪組以及祛邪組小鼠瘤體中Treg及IL-10、TGF-β的表達水平顯著降低。在控制瘤體、抑制腫瘤生長及瘤體免疫細胞因子正向及負向調控方面，健脾益氣扶正加祛濕化瘀解毒組均有明顯優勢，推測健脾益氣扶正加祛濕化瘀解毒法降低免疫抑制作用主要來源于其祛濕化瘀解毒法組分，而增強免疫促進作用主要來源于其中健脾益氣扶正法組分。對免疫功能的調節得益于健脾益氣扶正法、祛濕化瘀解毒法的共同作用，不同治則協同作用，從而提高機體免疫、誘導腫瘤細胞凋亡。