銀杏葉中奎寧酸和莽草酸的綜合提取研究

李俊，陳偉，楊明武，何珺

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025;2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(Ginkgobilobea.L.)的干燥葉,味微苦,性平,具有益心、活血止痛等功效[1-4]。銀杏葉中的活性成分有黃酮、萜內酯和有機酸等[5]，其中奎寧酸和莽草酸含量高達3%～5%。奎寧酸具有抗氧化性[6]，莽草酸具有抗菌、抗炎等藥理活性[7]。

莽草酸、奎寧酸為合成達菲原料[6，8]。目前市場上莽草酸主要來源于八角，但近年來八角價格不斷攀升，導致工業成本提高，市場急需尋求低價原料代替[9-11]。在銀杏葉中黃酮及內酯提取工藝基礎上[7]，對莽草酸和奎寧酸進行綜合提取工藝研究，充分利用銀杏葉資源。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

奎寧酸對照品(批號20112423，上海同田生物技術股份有限公司，含量>98%)；莽草酸對照品(批號20111203，上海同田生物技術股份有限公司，含量>98%)；磷酸、無水乙醇均為分析純；娃哈哈純凈水；甲醇，色譜純；蒸餾水,自制;銀杏葉，4月采自貴州省遵義市湄潭縣3年樹齡的銀杏，60 ℃真空干燥24 h。

Agilent Technologies 1260 InfinityHPLC-示差檢測器;BT25S電子分析天平；HH.W21-600C型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 提取實驗

按料液比1∶10 g/mL;加入體積分數85%的乙醇，在70 ℃提取2 h。

1.3 奎寧酸和莽草酸含量測定

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱(250×4.6 mm,5 μm)；流動相為甲醇：0.4%磷酸水(1∶99，v/v)；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.2 溶液制備 分別取奎寧酸、莽草酸對照品適量，精密稱定，加水制得對照品溶液。精密稱定銀杏葉1.00 g，按照相應條件提取，精密移取銀杏葉提取液1 mL，以水定容至10 mL，搖勻，經 0.45 μm 微孔濾膜濾過，注入進樣瓶，即得供試品溶液。按擬定色譜條件進行含量測定，結果見圖1、圖2。

圖1 對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance

圖2 供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the test product

1.3.3 標準曲線繪制 精密量取 0,2.4,4,6,8,10 mL的0.25 mg/mL奎寧酸標準溶液于10 mL試管中，加水稀釋至刻度線，混勻，制成系列奎寧酸標準溶液；精密量取0,1.6,3.2,3.5,4.8 mL的0.15 mg/mL莽草酸標準儲備液于10 mL試管中，加水稀釋至刻度線，混勻，制成系列莽草酸標準溶液。按照擬定方法條件進行含量測定。以奎寧酸質量濃度(mg/mL)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=115 477X+136.4，r=0.99，表明在0～ 0.25 mg/mL 范圍內，峰面積與奎寧酸濃度有良好的線性關系。以莽草酸質量濃度(mg/mL)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=132 125X+190.39，r=0.99，表明在0～0.30 mg/mL 范圍內，峰面積與莽草酸濃度有良好的線性關系。

2 結果與討論

2.1 提取溫度

料液比1∶10 g/mL,乙醇體積分數85%，提取時間2 h，考察提取溫度對提取效果的影響,結果見表1。

表1 提取溫度對奎寧酸和莽草酸提取影響(n=3)Table 1 The effect of extraction temperatures on the extraction of quinic acid and shikimic acid (n=3)

由表1可知，隨著溫度升高，銀杏葉中奎寧酸和莽草酸提取率越高，70,90 ℃時，奎寧酸和莽草酸提取含量最高，達3.8%左右，變化不大。因此，優先提取溫度為70 ℃。

2.2 提取醇濃度

料液比1∶10 g/mL，提取溫度70 ℃，提取時間2 h，考察乙醇體積分數對提取效果的影響,結果見表2。

表2 乙醇濃度對奎寧酸和莽草酸提取影響(n=3)Table 2 The effect of ethanol concentrations on the extraction of quinic acid and shikimic acid (n=3)

由表2可知，乙醇濃度越高，奎寧酸提取率越低，而莽草酸整體提取率變化不大。乙醇體積分數在30%時，奎寧酸含量達4.5%，莽草酸含量達3.9%，綜合提取率最高。但是，先前對銀杏葉中黃酮、內酯、莽草酸綜合提取研究表明，采用乙醇濃度為70%最好，而70%乙醇提取奎寧酸提取效果為30%提取時的84.3%。因此，考慮銀杏葉中黃酮、內酯、莽草酸三個組分提取效率，確定提取溶劑為70%乙醇。

2.3 提取時間及次數的考察

料液比為1∶10 g/mL，提取溫度為70 ℃，乙醇體積分數為70%，每次提取1 h，每次提取后進行抽濾，濾渣進行下一次提取。提取次數對提取效果的影響見表3。

表3 提取次數對提取效果的影響(n=3)Table 3 The influence of the number of extractions on the extraction effect(n=3)

由表3可知，第1次提取時，莽草酸提取率達70.35%，奎寧酸提取率達60.15%；第2次提取時，莽草酸總的提取率達20.55%，奎寧酸總的提取率達25.78%；第2次提取時，奎寧酸總的提取率為9.97%，莽草酸總的提取率為6.88%；第4次提取時，奎寧酸和莽草酸的提取率低至3.33%和2.33%。因此，綜合生產成本考慮，確定提取2次，第1次提取2 h，2次提取1 h，總的提取時間為3 h，奎寧酸總的提取率為96.67%，莽草酸總的提取率為97.77%。

2.4 正交實驗

在單因素實驗基礎上，對料液比、乙醇體積分數、提取溫度、提取時間進行正交實驗，因素水平見表4，結果見表5，方差分析見表6、表7。

表4 因素水平表(n=3)Table 4 Factor and level table (n=3)

表5 正交實驗結果(n=2)Table 5 Orthogonal experimental results (n=2)

表6 奎寧酸提取方差分析Table 6 Results of analysis of variance of quinic acid

表7 莽草酸提取方差分析Table 7 Analysis of variance results of shikimic acid

由表5可知，莽草酸含量變化不大，而奎寧酸含量波動較大。所以，將奎寧酸作為正交提取含量考察主要指標，因素的影響強度依次為B>D>C>A,A1B1C3D3為最優方案,即料液比1∶8 g/mL,乙醇體積分數為70%，提取溫度為70 ℃，提取時間3 h。

2.5 驗證實驗

平行取4組1.0 g銀杏葉，精密稱定，加8 mL體積分數為70%的乙醇溶液，70 ℃條件下，提取2次，即第1次為2 h，第2次為1 h,提取時間3 h。對提取液進行含量測定，綜合評分=奎寧酸含量評分+莽草酸含量評分;奎寧酸含量評分=(奎寧酸提取量/奎寧酸最大提取量)×100×0.5;莽草酸含量評分= (莽草酸提取量/莽草酸最大提取量)×100×0.5。結果見表8。

表8 驗證實驗Table 8 Verification experiment

由表8可知，正交實驗所得最佳參數在對銀杏葉中奎寧酸和莽草酸進行綜合提取時，能夠得到穩定高效的提取量，奎寧酸的含量達5.29%，莽草酸含量達4.90%，綜合評分達98.51。表明該工藝參數穩定可行，可用于銀杏葉中奎寧酸和莽草酸的綜合提取。

3 結論

對銀杏葉中奎寧酸和莽草酸進行綜合提取時，最優條件為：料液比1∶8 g/mL,乙醇體積分數為70%，提取溫度為70 ℃，提取時間為3 h。在第1次提取時間達到2 h以后，為避免提取溶液達到飽和狀態，采用新的溶劑進行第2次提取，從而達到提高提取率的目的。奎寧酸含量5.29%,莽草酸含量4.90%。