生物表面活性劑產生菌的誘變育種及特性研究

吳從文，劉曉麗，鐘世坤，馬艷清，裴 帥

(1.中國石油新疆油田分公司陸梁油田作業區，新疆 克拉瑪依 834000；2.中國石油新疆油田分公司實驗檢測研究院，新疆 克拉瑪依 834000；3.中國石油集團川慶鉆探工程有限公司國際工程公司，四川 成都 610000)

生物表面活性劑是微生物或植物在一定條件下培養時，在代謝過程中分泌的一種具有一定表界面活性、集親水基和疏水基結構于一分子內部的兩親化合物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性類脂衍生物等[1]。生物表面活性劑無毒，可以生物降解，對環境影響很小，熱穩定性和化學穩定性較好，具有高效的表面活性，是合成表面活性劑的理想替代品，受到研究者的廣泛關注[2]。生物表面活性劑能增大石油烴類物質在水相中的溶解度，降低表面張力，在石油采收和生物修復環境污染等方面具有巨大的應用潛力[3]。研究和開發生物表面活性劑的應用價值和潛力、優化發酵方法和降低發酵成本、篩選和培育生物表面活性劑高產菌株是當前主要的研究熱點和發展方向[4]。

生物表面活性劑的合成方法主要有微生物發酵法、酶合成法、天然生物提取法等[5-6]。其中通過微生物發酵法可以在不同的條件下得到不同類型的生物表面活性劑，在技術和經濟上非常適合批量生產[7]。微生物在發酵過程中，使用的菌種一般生長較慢，并且容易出現菌種退化的現象，因此需要通過自然或誘變選育來保持菌種的優良性能，防止菌種退化，同時進一步提高菌種的正突變率[8]。常見的誘變方法有紫外誘變、微波誘變、化學誘變等，由于微生物突變生理生化反應復雜，單一誘變往往難以篩選到優良菌株，因此，多采用復合誘變使菌株發生較大的突變，進而篩選出優良菌株以提高生物表面活性劑的產量[9]。Zouari等[10]從石油污染土壤中篩選出假單胞菌(Pseudomonassp.)，該菌株所產生物表面活性劑在高鹽度(10%)、高pH值(6～12)、高溫(80 ℃)時依然能夠保持較高的活性，同時可以降解柴油。張卉等[11]以NTG為誘變劑對出發菌株PseudomonasaeruginosaJZ-5進行誘變處理，以發酵液排油圈直徑和生物表面活性劑產量為指標進行復篩，選育出高產且遺傳穩定的突變菌株NTG-6，其排油圈直徑為6.7 cm，生物表面活性劑產量達到40.83 g·L-1，較出發菌株產量提高了50.84%。門欣等[12]篩選到一株生物表面活性劑產生菌PseudomonasaeruginosaBQ11，在15 W紫外燈下38 cm處誘變60 s后，獲得一株正突變率達28%的生物表面活性劑高產菌株UBQ11-4，糖脂產量從5.3 g·L-1提高到6.8 g·L-1，并且突變菌株UBQ11-4所產生物表面活性劑的特性(乳化性能和臨界膠束濃度)優于出發菌株。陳利娟等[13]對出發菌株進行常壓室溫等離子體誘變(ARTP)，選育出一株高產突變菌株PseudomonasaeruginosaSC-11，其鼠李糖脂產量比出發菌株提高了74.1%。沈薇等[14]采用紫外誘變和紫外+氯化鋰復合誘變對PseudomonasaeruginosaBS-03菌株進行誘變，篩選出一株生物表面活性劑高產菌株LY4，可將鼠李糖脂產量由4.1 g·L-1提高到6.8 g·L-1。

作者以新疆油田油井采出液中分離得到的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69為出發菌株，采用紫外線和亞硝基胍復合誘變的方法對菌株FC-69進行種子和搖瓶發酵培養；以發酵液的排油圈直徑和生物表面活性劑產量為考核指標，進一步篩選生物表面活性劑高產菌株，并對其特性進行研究，為豐富生物表面活性劑高產菌種資源和提高生物表面活性劑產量提供數據支持。

1 實驗

1.1 菌種與儀器

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69，分離自新疆油田油井采出液中，保存于克拉瑪依市新奧達石油技術服務有限公司。

紫外燈(30W/5A)，中國四通特種電光源；JA2103N型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；LDZM-80KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；DHP-500型電熱恒溫培養箱，北京永光明醫療儀器有限公司；HC-1014型高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；A101型全自動表面張力儀，美國科諾工業有限公司；BCD-205HK型電冰箱，廣東海信容聲冰箱有限公司；PHS-3C型pH計，上海雷磁儀器廠；SW-CS-2F型凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 培養基

平板(斜面)培養基(g·L-1)：葡萄糖3.0，蛋白胨8.0，酵母膏3.0，磷酸二氫鉀2.7，氯化鈉5.0，瓊脂20.0。

種子培養基(g·L-1)：牛肉膏2.0，氯化鈣0.05，磷酸氫二鉀2.0，葡萄糖10.0，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀2.0。

發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖20.0，硝酸銨3.0，磷酸氫二鉀1.5，硫酸鎂0.1，硫酸鐵0.01。

1.3 菌懸液的制備

刮取活化的FC-69菌株，于30 ℃、200 r·min-1搖瓶培養12 h后收集菌液，4 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，加入無菌生理鹽水，置于漩渦振蕩器上振蕩20 s使菌體混合均勻，用雙層無菌脫脂棉紗布過濾，即得菌懸液，用生理鹽水稀釋使菌濃為106個·mL-1左右，備用。

1.4 高產菌株的誘變選育

1.4.1 紫外誘變時間的選擇[15]

吸取5 mL菌懸液于無菌玻璃平皿，置于30 W紫外燈下15 cm處照射(紫外燈提前預熱30 min)；每隔一定時間(15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、115 s)吸取照射過的菌懸液，稀釋后涂布于平板培養基上，以未經紫外燈照射的菌懸液作為對照，用黑紙包裹后置于30 ℃培養箱中培養48 h；觀察平板上的菌落數，按式(1)計算致死率，確定合適的紫外誘變時間。

(1)

取菌懸液，按上述方法紫外誘變合適時間，分別挑取形態、大小、色澤優良的菌落經種子和搖瓶發酵培養后測定排油圈直徑；挑選排油圈直徑>3 cm的菌落進行液態發酵后再次測定排油圈直徑，平行測定3次，取平均值[16]。根據排油圈直徑增幅計算正突變率：

(2)

1.4.2 亞硝基胍濃度的選擇[17]

將菌懸液按1.4.1方法紫外誘變合適時間，稀釋后涂布于含不同濃度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)亞硝基胍的平板培養基上，以未涂布亞硝基胍的培養基作為對照，置于30 ℃培養箱中培養48 h；觀察平板上的菌落數，計算致死率，確定合適的亞硝基胍濃度。

取菌懸液，按上述方法紫外誘變合適時間后涂布在含合適濃度亞硝基胍的平板培養基上，分別挑取形態、大小、色澤優良的菌落經種子和搖瓶發酵培養后測定排油圈直徑。

1.4.3 高產菌株的篩選及遺傳穩定性實驗

取菌懸液，在確定的最佳條件下進行紫外線和亞硝基胍復合誘變，篩選生物表面活性劑高產菌株。將最終篩選的高產菌株進行傳代實驗，檢測生物表面活性劑產量，分析其高產性能的遺傳穩定性。

1.5 高產菌株的特性研究

將篩選的高產菌株經一級種子培養成熟后接種至發酵培養基，于30 ℃、200 r·min-1培養4 d，每12 h取樣測定菌體密度(OD值)、表面張力、乳化值和生物表面活性劑產量。

采用濁度法測定菌體密度[16]；采用表面張力儀測定發酵液的表面張力，平行測定3次，取平均值[18]；采用超聲體積比法測定乳化值[19]；生物表面活性劑產量測定方法：將發酵液pH值調至8.0，6 000 r·min-1離心20 min，上清液用超濾膜過濾，濾液于40 ℃下用旋轉蒸發器濃縮至原體積的20%，再將濃縮液pH值調至2.0，于4 ℃下靜置12 h，于4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀物(生物表面活性劑粗提物)[11]，稱重。

2 結果與討論

2.1 紫外誘變時間的確定

FC-69菌株在紫外誘變不同時間后，稀釋涂布于平板培養基上，計算致死率，結果見表1。

表1 FC-69菌株在紫外誘變不同時間后的致死率

由表1可知，隨著紫外誘變時間的延長，菌落數逐漸減少，FC-69菌株的致死率逐漸升高；0～75 s內致死率快速升高，75 s之后致死率升幅趨緩。紫外誘變60 s時，致死率為88.98%；紫外誘變90 s時，僅長出1個菌落，致死率達到99.21%；紫外誘變115 s時，菌株已無法生長。通過前期實驗驗證，致死率一般在80%左右時正突變率較高，因此，選擇紫外誘變時間為60 s。

2.2 紫外誘變排油圈直徑測定結果

FC-69菌株紫外誘變60 s后，通過培養共篩選出52個形態、大小、色澤優良的菌落，經過種子和搖瓶發酵培養后測定排油圈直徑，結果見表2。

表2 FC-69菌株紫外誘變后的排油圈直徑測定結果

由表2可知，FC-69菌株經紫外誘變后，排油圈直徑基本呈正態分布。排油圈直徑在5.0～5.9 cm的菌落最多，有16個，其次是在4.0～4.9 cm的，有12個；排油圈直徑大于3.0 cm的菌落有47個，占菌落總數的90.38%；排油圈直徑大于7.0 cm的菌落有2個，占菌落總數的3.85%；排油圈直徑大于出發菌株FC-69的有9個，占菌落總數的17.31%，其中最大的達到7.2 cm，較出發菌株提高了16.13%。

2.3 亞硝基胍濃度的確定

FC-69菌株紫外誘變60 s后，稀釋涂布于含有不同濃度亞硝基胍的平板培養基上，計算致死率，結果見表3。

表3 FC-69菌株在復合誘變后的致死率

由表3可知，隨著亞硝基胍濃度的增加，菌落數逐漸減少，FC-69菌株的致死率逐漸升高；當亞硝基胍濃度為0.5%時，僅長出1個菌落；當亞硝基胍濃度為0.6%時，菌株已不能生長，這也是菌株對亞硝基胍的耐受臨界濃度。因此，選擇0.4%的亞硝基胍對FC-69菌株進行復合誘變。

2.4 復合誘變排油圈直徑測定結果

FC-69菌株紫外誘變60 s后，稀釋涂布于含有0.4%亞硝基胍的平板培養基上，通過培養共篩選出55個形態、大小、色澤優良的菌落，經過種子和搖瓶發酵培養后測定排油圈直徑，結果見表4。

表4 FC-69菌株復合誘變后的排油圈直徑測定結果

由表4可知，FC-69菌株經復合誘變后，排油圈直徑在5.0～5.9 cm的菌落最多，有14個；排油圈直徑大于7.0 cm的菌落有3個，占菌落總數的5.45%；排油圈直徑大于出發菌株FC-69的有10個，占菌落總數的18.18%，其中最大的達到7.35 cm，較出發菌株提高了18.55%。

2.5 高產菌株的遺傳穩定性

在紫外誘變時間為60 s、亞硝基胍濃度為0.4%的條件下對FC-69菌株進行復合誘變，挑選6個排油圈直徑較大的菌落進行重復驗證實驗，經過種子和搖瓶發酵培養后測定排油圈直徑和生物表面活性劑產量，結果見表5。

表5 高產菌株的篩選

由表5可知，FC-69-52菌株的排油圈直徑達到7.12 cm，生物表面活性劑產量達到42.86 g·L-1，分別較出發菌株FC-69提高了14.84%和19.06%。

對高產菌株FC-69-52進行遺傳穩定性實驗，結果顯示：該菌株在傳代1～5代后的生物表面活性劑產量分別為：42.31 g·L-1、41.92 g·L-1、42.56 g·L-1、42.19 g·L-1、42.03 g·L-1，變化不大，說明復合誘變選育的高產菌株遺傳穩定性較好。

2.6 高產菌株的特性(圖1)

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，發酵液表面張力呈先降低后升高的變化趨勢，菌體密度、乳化值、生物表面活性劑產量則呈先升高后降低的變化趨勢。發酵0～48 h，較強的疏水性能增加了高產菌株FC-69-52與環境有機物的接觸機會，菌體密度顯著上升，發酵液表面張力大幅下降，并產生大量的生物表面活性劑；發酵48 h，發酵液表面張力降至最低(27.05 mN·m-1)，生物表面活性劑產量達到最高(42.21 g·L-1)，乳化值也達到最高(65.68%)；發酵60 h后，高產菌株FC-69-52生長進入衰亡期，菌體密度開始緩慢下降，發酵液表面張力維持在30.00 mN·m-1左右，乳化值和生物表面活性劑產量緩慢下降，但整體穩定性良好，說明菌株FC-69-52所產生物表面活性劑對油水界面的親和力更強，可使乳化相在96 h內保持穩定。

圖1 高產菌株FC-69-52的特性

3 結論

以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69為出發菌株，經過紫外線和亞硝基胍復合誘變，篩選得到了一株生物表面活性劑高產菌株FC-69-52，其排油圈直徑達到7.12 cm、生物表面活性劑產量達到42.86 g·L-1，分別較出發菌株提高了14.84%和19.06%。該高產菌株發酵48 h，生物表面活性劑產量達到42.21 g·L-1，乳化值達到65.68%，發酵液表面張力降至27.05 mN·m-1，對油水界面的親和力更強，可使乳化相在96 h內保持穩定，可作為優良高產菌株保存使用。該研究為微生物發酵法產生物表面活性劑的工業化提供了優質菌種資源和發酵工藝指導。