垃圾填埋場中不同填埋年限固體廢棄物的抗生素抗性基因污染特征*

李中浤 李曉光 黎佳茜 陳素華

(1.南昌航空大學環境與化學工程學院，江西 南昌 330063；2.中國環境科學研究院,國家環境保護地下水污染過程模擬與控制重點實驗室，北京 100012)

抗生素在醫學發展、現代農業和畜牧業中發揮著重要的作用[1]，中國作為世界上抗生素最大的生產者和使用者之一，每年生產和消費的抗生素分別達到24.8萬、16.2萬t[2]。抗生素一直存在過度使用和長期濫用的現象，過量服用的抗生素會隨排泄物進入環境，導致環境中具有抗生素抗性基因(ARGs)和攜帶有抗生素抗性的耐藥菌(ARB)大量增加[3]。隨著越來越多具有多重耐藥性的“超級細菌”的出現，抗生素耐藥性對人類健康構成了極大的威脅[4]。目前，在城市污水處理廠[5]、湖泊[6]、農田土壤[7]、河流[8]、空氣[9]等各類環境介質中均檢測出ARGs[10]。ARGs作為一種新型污染物已成為21世紀全球公共衛生的最大威脅之一[11]。

垃圾填埋場是城市固體廢棄物的最終處置場所，全球垃圾填埋場每年接受約3.5億t城市固體廢棄物，其中大量過期抗生素類藥物會隨著生活垃圾進入垃圾填埋場中，使得城市垃圾填埋場成為抗生素和ARGs的重要“源”和“匯”[12]。除了抗生素外，垃圾填埋場中各種重金屬和有機污染物的存在也會影響ARGs和ARB的傳播[13]。WANG等[14]調查了3個垃圾填埋場中不同填埋年限的固體廢棄物中抗生素和ARGs濃度，結果顯示在檢測的15種抗生素中有14種抗生素在填埋年限較短的固體廢棄物中濃度較高，這可能是由于不同抗生素具有不同的物理化學性質，導致在固體廢棄物中的吸附能力有所差異，而且微生物活性和生物降解特征的不同也是導致抗生素濃度出現差異的重要原因之一[15]。相反，在固體廢棄物中檢測出的多種ARGs卻呈現出隨著填埋年限的增加而增高的趨勢。目前關于垃圾填埋場固體廢棄物ARGs的研究主要是針對磺胺類、四環素類、喹諾酮類等少數幾種抗生素的ARGs，如sul1、sul2、tetA、tetC、qnrA、qnrB等，無法全面反映垃圾填埋場中ARGs的種類和分布格局。

目前，越來越多的基于脫氧核糖核酸(DNA)的分子生物學技術用于檢測和定量分析環境中的ARGs，如聚合酶鏈式反應(PCR)、實時定量PCR、熒光定量PCR(qPCR)、高通量PCR和宏基因組測序技術(mNGS)等[16]。其中，mNGS可克服PCR、qPCR和高通量PCR檢測技術引物或探針設計與選擇的限制，獲得環境中所有抗性基因的序列信息，并挖掘未知抗性基因的信息[17]，因此mNGS已經成為研究環境中ARGs的有效方法。然而，應用該技術對垃圾填埋場中ARGs的研究卻鮮有報道。為此，本研究以內蒙古巴彥淖爾市的某垃圾填埋場為研究對象，采用mNGS對不同填埋年限固體廢棄物中ARGs的分布規律和污染水平進行分析，以期為固體廢棄物ARGs的污染狀況、擴散及傳播規律研究提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預處理

內蒙古巴彥淖爾市某垃圾填埋場位于臨河城北郊，距市中心7 km，建設規模為日處理生活垃圾450 t，設計庫容為129.94萬m3。本研究于2020年11月20日分別采集了填埋年限分別為2、5、8年的表層固體廢棄物，-4 ℃冷藏運回實驗室，使用凍干機進行凍干處理，去除塑料袋、砂石等大顆粒物質后進行研磨，過40目篩網后置于-40 ℃冰箱冷凍保存，用于DNA提取。

1.2 DNA提取

采用土壤DNA快速提取試劑盒(美國MP)完成固體廢棄物DNA抽提，而后利用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA的純度和完整性，采用Qubit 2.0型熒光光譜儀(美國Thermo Scientific)檢測PCR擴增后DNA的產量。基因組DNA樣品用干冰保藏并立即送樣測序，測序平臺使用NovaSeq 6000(美國illumina)，采用PE150測序策略進行雙端測序。

1.3 測序及生物信息學分析

參考文獻[16]，使用Trimmonatic軟件對原始測序數據進行質量控制，去除低質量測序數據，得到有效測序數據，應用USEARCH和BlastX軟件將測序數據與構化抗生素耐藥基因(SARG)數據庫進行對比注釋[18]，對注釋后的數據參照SARG數據庫將ARGs分成不同的抗性類型，包括氨基糖苷類、桿菌肽類、β-內酰胺類、博來霉素類、碳霉素類、氯霉素類、磷霉素類、膦胺霉素類、鐮刀菌酸類、夫西地酸類、春雷霉素類、大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、多藥類、多黏菌素類、嘌呤霉素類、喹諾酮類、利福霉素類、壯觀霉素類、磺胺類、特曲霉素類、四環素類、甲氧芐氨嘧啶類、萬古霉素類和未分類。參考文獻[17]，將檢測結果基于16S拷貝數標準化，計算出不同抗性類型ARGs的相對豐度。

2 結果與討論

2.1 ARGs抗性類型和相對豐度變化

基于SARG數據庫比對結果，3種固體廢棄中共檢測出21類ARGs，鐮刀菌酸類、夫西地酸類和壯觀霉素類ARGs未檢出。其中填埋2、5、8年的固體廢棄物中分別檢測出19、18、20類ARGs，總相對豐度分別達3.783×10-1、4.267×10-1、6.741×10-1。碳霉素類、嘌呤霉素類ARGs僅在填埋8年的固體廢棄物中測出；春雷霉素類ARGs在填埋2、5年的固體廢棄物中檢出；特曲霉素類ARGs在填埋2、8年的固體廢棄物中檢出。不同ARGs的相對豐度分布見圖1。

由圖1可見，氨基糖苷類、四環素類、氯霉素類、磺胺類、利福霉素類、喹諾酮類和甲氧芐氨嘧啶類ARGs的相對豐度均隨著填埋年限的增加而增加，桿菌肽類、未分類ARGs的相對豐度隨填埋年限的增加而降低，相對豐度較高的大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、多藥類、萬古霉素類ARGs的相對豐度隨填埋年限的增加變化規律不明顯。甲氧芐氨嘧啶類、磺胺類ARGs隨著填埋年限的增加相對豐度增長比例相對明顯，其中甲氧芐氨嘧啶類ARGs在填埋年限2、8年的固體廢棄物中相對豐度分別為1.325×10-4、6.193×10-3，相對豐度增加了45.74倍。整體相比，填埋8年的固體廢棄物中ARGs的總相對豐度比填埋2年的固體廢棄物增加了2.958×10-1。王柳紅等[19]研究表明垃圾滲濾液年限與ARGs相對豐度呈正相關，但YU等[20]研究發現隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中ARGs相對豐度會下降。造成該差異的主要原因可能是垃圾填埋場中ARGs不僅僅與填埋年限有關，也與垃圾填埋場中重金屬、光照、有機物、營養鹽以及微生物群落結構等因素變化有關。

圖1 固體廢棄物中不同ARGs的相對豐度Fig.1 The relative abundance of different ARGs in solid waste

依據優勢ARGs的判斷標準(在樣本組中的相對豐度占比≥1%)，對固體廢棄物中的優勢ARGs進行統計，結果見表1。

由表1可見，隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中個別優勢ARGs種類和相對豐度發生了變化。填埋2年的固體廢棄物中共有11類優勢ARGs，豐度占比從大到小依次為大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、多藥類、萬古霉素類、桿菌肽類、氨基糖苷類、未分類、四環素類、氯霉素類、膦胺霉素類、磺胺類和利福霉素類；填埋5年的固體廢棄物中共有10類優勢ARGs，豐度占比從大到小依次為大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、多藥類、氨基糖苷類、氯霉素類、磺胺類、桿菌肽類、四環素類、萬古霉素類、未分類和β-內酰胺類；填埋8年的固體廢棄物中共有8類優勢ARGs，豐度占比從大到小依次為大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、磺胺類、多藥類、氯霉素類、氨基糖苷類、四環素類、萬古霉素類和桿菌肽類。3種固體廢棄物所共有的8類優勢ARGs相對豐度占比合計均在90%以上，是固體廢棄物中最主要的ARGs。ZHAO等[21]通過使用mNGS技術分析了中國12座城市垃圾填埋廠中ARGs的分布特征，也發現大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、氨基糖苷類、多藥類和四環素類是ARGs的主要抗性類型，其相對豐度占比達到71.1%～93.0%。

表1 固體廢棄物中優勢ARGs相對豐度的占比Table 1 The proportion of the relative abundance of advantage ARGs in solid waste %

2.2 ARGs亞型的種類

不同填埋年限的固體廢棄物中共有及特有的ARGs亞型數目見圖2。

3種固體廢棄物中共檢測出259種ARGs亞型，高于CHI等[22]在醫廢堆置區內檢測出的ARGs亞型數。其中填埋2、5、8年的固體廢棄物中分別檢測出160、196、206種ARGs亞型，特有的ARGs亞型分別有12、23、36種，3種固體廢棄物中共有的ARGs亞型有115種，數目占比達44.4%。隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中ARGs亞型的數目也隨之增加。填埋2年的固體廢棄物中mefA的相對豐度最高，填埋5、8年的固體廢棄物中均為ermF相對豐度最高，mefA、ermF均屬于大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類ARGs。

圖2 不同填埋年限固體廢棄物中共有和特有的ARGs亞型數目Fig.2 The number of mutual and unique ARGs subtypes in the solid waste with different ages

抗生素和ARGs廣泛存在于各種環境媒介中[23]，其中四環素類和磺胺類ARGs傳播最廣泛，對人體潛在危害最大，也是垃圾填埋場中研究較多的ARGs類型。為此，本研究對不同填埋年限的固體廢棄物中四環素類和磺胺類ARGs亞型進行進一步分析。本研究共檢測出4種磺胺類ARGs亞型，分別為sul1、sul2、sul3、sul4。在填埋2、5、8年的固體廢棄物中，磺胺類ARGs相對豐度分別5.031×10-3、2.966×10-2、1.416×10-1，增幅十分明顯。sul2是填埋8年的固體廢棄物中所特有的ARGs亞型，sul1的相對豐度呈現出隨填埋年限的延長而增加的趨勢，而SONG等[24]研究結果與本研究相反，認為sul1的相對豐度與填埋年限呈負相關，這可能是不同垃圾填埋場存在一定差異性從而導致個別ARGs亞型變化趨勢的不同。

3種固體廢棄物中共檢測出27種四環素類ARGs亞型，其中在填埋2年的固體廢棄物中，四環素類ARGs相對豐度為1.055×10-2，隨著填埋年限延長到5、8年，四環素類ARGs相對豐度分別增加到1.954×10-2、5.076×10-2，可能是固體廢棄物中含有一定的四環素類抗生素殘留，從而產生較大的選擇壓力，有利于四環素類ARGs的增加和傳播[25]。綜上可知，隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中ARGs的豐度以及多樣性均會隨之增加，從而增加其潛在環境風險。

3 結 論

(1) 基于mNGS從填埋2、5、8年的固體廢棄物中檢測出19、18、20類ARGs，總相對豐度分別為3.783×10-1、4.267×10-1、6.741×10-1，表明城市生活垃圾填埋場是ARGs的重要儲存庫。

(2) 3種固體廢棄物所共有的8類優勢ARGs分別為大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、磺胺類、多藥類、氯霉素類、氨基糖苷類、四環素類、萬古霉素類和桿菌肽類，相對豐度占比合計均在90%以上，是固體廢棄物中最主要的ARGs。

(3) 固體廢棄物中共檢測出259種ARGs亞型，其中填埋2、5、8年的固體廢棄物中分別檢測出160、196、206種ARGs亞型，相對豐度最高的ARGs亞型均屬于大環內酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類。

(4) 固體廢棄物ARGs中檢測出4種磺胺類和27種四環素類ARGs亞型。隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中ARGs的豐度以及多樣性也會隨之增加，從而使潛在環境風險逐漸增大。