高效液相色譜法測定和血明目片中龍膽苦苷、木犀草苷和黃芩苷含量

安艷蘇，畢秋左，張順平

曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

和血明目片是收載于《中國藥典》的處方藥，由蒲黃、丹參、地黃、墨旱蓮、菊花、黃芩、龍膽等十九味中藥組成，主要功能涼血止血、滋陰化瘀、養肝明目，可用于陰虛肝旺，熱傷經脈所引起的眼底出血［1］。龍膽中的龍膽苦苷具有抗炎、抗癌、利膽等作用［2-4］。黃芩含多種黃酮類化合物，主要有黃芩苷、黃芩素等，具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態及解痙作用［5-8］。菊花中的木犀草苷具有祛痰、止咳、平喘的作用［9-10］。本文采用高效液相色譜法同時測定和血明目片中的龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷的含量。方法專屬性強、操作簡便、穩定、結果準確，適用于和血明目片產品的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，包括G7129A 型四元泵、G7115A 型自動進樣器及柱溫箱和G7162A 型紫外檢測器）；MS205DU 電子分析天平（上海梅特勒儀器有限公司）；AS-B 系列超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。色譜柱：Hypersil ODS2 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）(大連依利特分析儀器有限公司，柱號：E2816705，批號：15112)。

1.2 試藥

龍膽苦苷對照品（批號110770-201515，含量100.0%）；木犀草苷對照品（批號111720-201408，含量94.9%）；黃芩苷對照品（批號110715-201720，含量93.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇（分析純，成都市科隆化學品有限公司，批號2021072001）；乙腈（色譜純，德國默克有限公司，批號72-2440）；水為超純水。和血明目片（國藥準字Z20073062，規格：0.31 g）均購自西安碑林藥業股份有限公司（批號：PA221010021、PA220060501、PA220060402）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備

取樣品適量，研細，取0.6 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2 陰性樣品溶液制備

按照和血明目片處方比例及工藝方法分別制備不含龍膽、菊花、黃芩的陰性樣品，并按“2.1”項下方法，制成陰性樣品溶液。

2.3 混合對照品溶液的制備

2.3.1 龍膽苦苷、黃芩苷混合對照品的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品10.05 mg，黃芩苷對照品14.22 mg于同一25 mL 容量瓶中，加適量甲醇充分溶解，甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.2 木犀草苷對照品的制備 精密稱取木犀草苷對照品10.80 mg 于50 mL 容量瓶中，加適量甲醇充分溶解，甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.3 混合對照品溶液的制備 分別精密吸取“2.3.1”項下的混合對照品5 mL，“2.3.2”項下的對照品4 mL 于同一25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得龍膽苦苷80.40 μg/mL，木犀草苷32.80 μg/mL，黃芩苷106.37 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～7 min，90% A；7～11 min，90%→87% A；11～20 min，87%→82% A；20～43 min，82%→80% A；43～44 min，80% →50% A；44～50 min，50% A；50～51 min，50%→90% A；51～55 min，90% A）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

2.5 系統適用性試驗及專屬性考察

按照“2.4”項下色譜條件下，取陰性樣品溶液、混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL 進樣，記錄色譜圖。龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷的保留時間依次為11.7 min、25.4 min、42.4 min；理論板數依次為12 535、85 439、51 314；3 個成分均完全分離，陰性樣品溶液在與混合對照品溶液相應保留時間處未出現色譜峰，說明和血明目片中的其他成份對測定無干擾，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.混合對照品；B.樣品；C.龍膽陰性樣品；D.菊花陰性樣品；E.黃芩陰性樣品

2.6 線性關系考察

精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液適量，分別稀釋成5 個不同濃度的混合對照品系列，按“2.4”項下色譜條件進行測定，以進樣濃度X 為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標，進行線性回歸，計算回歸方程，結果見表1。

表1 3種成分的線性回歸方程

2.7 重復性試驗

取已知含量的和血明目片樣品（批號PA22101 0021），分別按照“2.1”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.4”項下的方法測定其含量，結果龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷3 種成分的含量的RSD 值分別為2.21%、1.42%、1.82%，結果表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取同一供試品溶液，室溫下分別于0、8、16、24、30 h 進樣測定，考察龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷在室溫下溶液的穩定性，記錄色譜圖，以峰面積進行計算，結果RSD 分別為1.21%、0.89%、1.05%。結果表明供試品溶液在室溫下30 h 內穩定。

2.9 加樣回收率試驗

取6 份已知含量的樣品（批號PA221010021），每份約0.3 g，精密稱定，分別精密加入“2.3.1”項下的混合對照品2.5 mL、“2.3.2”項下的對照品0.5 mL，按“2.1”項下的方法制備加樣回收樣品溶液，按“2.4”項下的色譜條件進樣，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 3種成分的回收率結果（n=6）

2.10 樣品測定

取3 批次和血明目片樣品（批號：PA221010021、PA220060501、PA220060402），每批各取3 份，分別按“2.1”項下方法制得供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進行測定，按“2.6”項下回歸方程計算各成分的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 樣品提取條件的優化

和血明目片由十九味中藥材組成，化學成分比較復雜，供試品的制備通過參考相關文獻［5-10］，以超聲提取為基礎，依次考察了甲醇、乙醇、50%甲醇和50%乙醇作為提取溶劑，提取時間考察了20 min、30 min、45 min、60 min，結果顯示以乙醇為溶劑時，龍膽苦苷和木犀草甘峰形不太好，用甲醇和50%甲醇提取時，甲醇提取效率較高，30 min 內能提取完全，并且各成分分離度較好，峰形理想，因此本試驗最終選擇了50 mL 甲醇超聲提取30 min，作為最終的提取方法。

3.2 波長的選擇

本方法選用DAD 檢測器在200～400 nm 波長處，分別掃描龍膽苦苷、木犀草甘、黃芩苷對照品溶液和供試品溶液，結果表明3 個主要成分的最大吸收波長均不相同，在254 nm 波長條件下，HPLC 圖譜中色譜峰峰形和峰強度均較為理想，故本試驗最終選擇254 nm 作為檢測波長。

3.3 流動相的考察

對不同流動相組成及比例進行考察，發現在流動相中加入一定比例的酸有助于提高待測成分與雜質峰之間的分離度，且峰形好，經過進一步考察，確定用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相系統進行梯度洗脫，可以獲得理想的色譜圖。

4 總結

本試驗建立高效液相色譜法同時測定和血明目片中龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷的方法。現行和血明目片標準含量測定僅以丹參素作為指標成分，本試驗所建立的含量測定方法能對3 味主藥（龍膽、菊花、黃芩）的含量同時進行控制，該方法前處理方法簡便、快捷，梯度洗脫方法靈敏、準確，測定結果穩定、可靠，重復性好，適用性強，樣品的分離度較好，陰性樣品無干擾，能夠為和血明目片的質量控制提供更準確、更全面的參考依據。