基于HS-SPME-GC-MS和OAV鑒定浮梁紅茶關鍵呈香物質

岳翠男，秦丹丹，李文金, ，吳華玲, ，蔡海蘭，李 琛，楊普香

（1.江西省蠶桑茶葉研究所，江西 南昌 330043；2.江西省茶葉質量與安全控制重點實驗室，江西 南昌 330043；3.江西省經濟作物研究所，江西 南昌 330043；4.廣東省農業科學院茶葉研究所，廣東 廣州 510640）

浮梁產茶歷史悠久，南北朝時期就已成為南方茶葉主要集散地，唐代詩人白居易的《琵琶行》中寫有“商人重利輕別離，前月浮梁買茶去”，素有“古茶市”之稱[1]。浮梁工夫紅茶，又“浮梁紅茶”，創制于清道光年間，簡稱“浮紅”，其品質特征干茶緊細，有鋒苗，茶湯紅亮，香氣呈甜香，時有玫瑰花香，芬芳馥郁持久，滋味鮮爽醇厚，回甘顯，葉底紅銅色，嫩勻整[2]。因其獨特風味品質特征，同祁紅與斯里蘭卡、大吉嶺紅茶統稱為世界三大高香茶，并在1915年的巴拿馬“萬國博覽會”上榮獲金質獎章和獎狀，足見其獨特品質與國際地位[3]。茶葉特征性風味品質來源于其非揮發性與揮發性代謝物組分[4]。前期，蔡海蘭等[5]對浮梁紅茶的滋味物質基礎與品質評價進行了探討。而關于浮梁紅茶的揮發性香氣組分與關鍵呈香物質尚無研究，因此，研究浮梁紅茶的揮發性香氣組分對解析浮紅的特征性風味品質與品質定向調控具有重要意義。

香氣是決定茶葉品質的重要因素之一，對茶葉風味、評判等級以及消費者導向等都具有十分重要的作用。茶香是不同的揮發性物質通過不同濃度組合，對嗅覺神經綜合作用所形成的特有香型[6]。在茶葉的揮發性成分中存在少量關鍵呈香成分，對茶葉的風味品質具有重要影響[6]。目前，在眾多揮發性物質檢測方法中，HS-SPME-GC-MS具有簡單、快速、分析成本低及接近真實茶香等優勢，在茶葉揮發性成分檢測中廣泛運用[7]。OAV是揮發性物質濃度與其對應介質中氣味閾值的比值，其值越大，說明該物質對呈香越重要，是關鍵呈香成分分析的重要手段，此方法可通過理論值的計算來表征揮發性物質香氣的貢獻度[8]。多元統計分析方法中PCA能將重復和交互的變量進行簡化，用最關鍵的變量來解決復雜的問題[9]。基于此，本研究擬采用HS-SPME-GC-MS來定性與定量浮梁紅茶的揮發性組分，運用OAV與PCA方法相結合篩選浮紅的關鍵呈香揮發性物質，以期為解析浮紅的特征性風味品質與明確其香氣物質前體提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3份具有代表性的市售浮梁紅茶成品 分別購買于浮梁縣3個不同的鄉鎮，其中，浮紅1生產于瑤里鎮，樣品標準為一芽一、二葉，生產時間為2019年4月上旬；浮紅2生產于西湖鄉，樣品標準為一芽二葉，生產時間為2019年4月中旬；浮紅3生產于江村鄉，樣品標準為一芽二、三葉，生產時間為2019年4月中旬；茶樹品種均為浮梁櫧葉群體種；各浮梁紅茶樣品的加工工藝流程為：鮮葉→萎凋→揉捻→發酵→干燥→提香→包裝；采購的每個樣品采用統一規格的茶葉專用鋁箔袋包裝，存放于?4 ℃冰箱，用于揮發性成分檢測；癸酸乙酯（99%）Sigma公司。

Agilent 7890B-5977B_PAL RSI 120氣相色譜-質譜聯用儀、DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 安捷倫科技（中國）有限公司；固相微萃取裝置SPME AllowCond、老化裝置Fiber Conditioning Station、樣品加熱箱Agitator 瑞士思特斯分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取 將3份茶樣進行粉碎，分別稱取1.5 g粉碎后的茶樣，放入20 mL頂空進樣瓶中，在進樣瓶中加入20 μL癸酸乙酯（濃度為0.02 mg/mL），加入5 mL沸騰的蒸餾水。將上述進樣瓶在60 ℃恒溫條件下振蕩15 min，振蕩器速度控制為450 r/min（時間為5 s開，2 s關），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（Sigma公司）萃取，萃取頭萃取前先在Fiber Conditioning Station中老化2 h，采樣前后分別在Fiber Conditioning Station中加熱解吸去雜10 min，將萃取頭插入進樣瓶頂空部分，萃取60 min，在250 ℃下解析5 min，最后采用GC-MS鑒定[10]。每個樣品采用3次重復。

1.2.2 色譜與質譜條件 GC-MS設備為Agilent 7890B-5977B（GC-MS）PAL RSI 120。色譜條件：采用DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，Folsom，CA，USA），載氣使用高純氦氣（純度大于99.999%），進樣口溫度為260 ℃，恒流流速為1.0 mL/min，不分流進樣，溶劑延遲為1.5 min。程序升溫以40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。質譜條件：電子轟擊離子源（EI），離子源溫度為230 ℃，質譜接口溫度為280 ℃，四極桿溫度為150 ℃，檢測器電壓為901 V，電子能量為70 eV，掃描方式使用全掃描模式（SCAN），質量掃描范圍為20～650 m/z。

1.2.3 揮發性成分定性 將GC-MS分析得到的各色譜峰的質譜圖在鹿明生物自主研發的LUG數據庫Lumingbio進行相似度比對，結合標準質譜圖和保留時間對各峰進行確認，以比對相似度大于90%作為鑒定標準，獲得定性揮發性化合物[10]。

1.2.4 揮發性成分定量 采用內標癸酸乙酯定量香氣成分，每個揮發性成分的含量按照公式（1）計算：

式中：Wi表示每個揮發性成分的含量（μg/kg）；Si表示揮發性成分的峰面積；Mis表示內標癸酸乙酯的質量（μg/kg）；Sis表示內標癸酸乙酯的峰面積；Mi表示樣品的質量（kg）[11?12]。

1.2.5 氣味活度值計算 OAV為揮發性化合物質量濃度與該物質嗅覺閾值的比值，按公式（2）計算：

式中：Oi表示揮發性成分的氣味活度值；Wi表示每個揮發性成分的含量（μg/kg）；Qi表示每個揮發性成分在參考文獻中的氣味閾值（μg/kg）[13?14]。

1.3 數據處理

揮發性成分百分比圖采用Origin 2018制作；采用SPSS 19.0進行LSD方差分析，采用The Unscrambler Version 9.7進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 浮梁紅茶揮發性物質組分分析

浮梁紅茶的揮發性組分總離子流圖見圖1，其揮發性成分定性定量及香氣類型描述見表1。浮梁紅茶揮發性成分總量為6268.60～9123.38 μg/kg，均值為7899.32 μg/kg，其中樣品浮紅2的揮發性成分含量最高，浮紅1的最低。在浮梁紅茶中共檢測到73種揮發性成分，包括醇類16種、酯類12種、碳氫化合物11種、酮類10種、醛類9種、酸類6種、雜環類6種和酚類及其衍生物3種。差異性分析顯示在檢測到的揮發性化合物中44種無顯著性差異（P>0.05），29種在部分樣品之間存在顯著性差異（P<0.05），說明此44種無顯著性差異的揮發性成分為浮紅的基本香氣成分，如芳樟醇、2-呋喃甲醇、Z-3-己烯-1-醇、水楊酸甲酯、2-甲基吡嗪等，以酸類、酮類、酯類和雜環類居多；存在顯著性差異的29種揮發性成分是讓浮紅產生品質差異（花香、甜香、蜜香、木香等）的主要原因，如香葉醇、橙花醇、苯乙醇、苯乙醛、α-紫羅酮等，以醇類和醛類居多。

表1 浮梁紅茶的揮發性物質及定量結果（μg/kg）Table 1 Volatile compounds and quantitative results of Fuliang black tea (μg/kg)

圖1 3份浮梁紅茶揮發性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components in three Fuliang black teas

從浮紅揮發性成分含量上來看，含量較高的成分為香葉醇、苯乙醇、水楊酸甲酯、苯甲醇、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、己酸、芳樟醇、二氫芳樟醇、α-紫羅酮、苯甲醛、羅勒烯、苯乙醛、2-呋喃甲醇和香葉基丙酮，其中，香葉醇含量為1631.0～2937.8 μg/kg，均值為2444.84 μg/kg；苯乙醇含量為906.46～

1740.25 μg/kg，均值為1308.7 μg/kg；水楊酸甲酯含量為705.74～967.18 μg/kg，均值為843.79 μg/kg，這些成分的香型均為典型的甜香、花香、果香、蜜香等。竹尾忠一對中國工夫紅茶香氣特征進行研究，表明閩紅與祁紅的香葉醇含量高，兩廣地區紅茶芳樟醇及其氧化物含量較高，把紅茶分為三種類型，第一種是以芳樟醇及其氧化物為主，第二種是中間型，以芳樟醇和香葉醇為主，第三種類型是以香葉醇為主[15]。由此來看，浮紅與閩紅和祁紅在高揮發性成分含量上相似，均以香葉醇為主，在分類屬于第三種類型，在香氣上均有較強的甜香、花香[2]。

從揮發性成分香氣類型描述上來看，對浮紅香氣風味品質呈正貢獻（甜香、花香、果香、清香、焙烤香等）的有57種、對香氣風味品質有負貢獻的（苦辣氣味、刺激臭味、苦杏仁味、青氣、粗老氣、酸味）有16種，以刺激性酸味的酸類物質為主。這些呈負貢獻的物質在浮梁紅茶中含量相比與正貢獻成分的含量和數量明顯較少，這可能是浮梁紅茶香氣整體呈甜香、花香且馥郁持久的重要原因，但在浮紅加工過程中，應最大可能地降低這些負貢獻物質的含量，增加正貢獻物質的含量。

續表 1

2.2 浮梁紅茶揮發性物質種類分析

浮梁紅茶揮發性成分的種類占比見圖2，共分為8類，此8類共同構成了浮紅的香氣特征，其中以醇類含量最高，占揮發性成分的64%～71%，其次為酯類，占揮發性成分的10%～18%，依次為醛類（5%～6%）、酸類（5%）、酮類（3%～5%）、碳氫化合物類（4%）、酚類及其衍生物（0～1%）和雜環類（0～1%）。肖作兵等[19]在坦洋工夫紅茶、宜昌工夫紅茶、祁門工夫紅茶、滇紅工夫紅茶中共檢測到揮發性成分75～77種，4種工夫紅茶醇類物質含量最高，其次是醛類、酯類。尹鵬等[20]在信陽紅中檢測到88種揮發性成分，醇類含量最高，其次為醛類、酯類、酮類。與此相比，浮紅也以醇類含量最高，不同的是，浮紅的酯類含量比醛類、酸類和酮類的含量都高，這可能是浮紅特征性香氣與其他工夫紅茶香氣產生差異的主要原因。不同浮紅樣品之間存在部分差異，浮紅2在3個樣品中醇類含量占比最高，酯類含量占比最低；浮紅1在3個樣品中酯類含量占比最高，醇類含量占比最低，浮紅3介于兩者之間。3個樣品來源于不同的鄉鎮，但品種與加工工藝相同，由此來看，浮梁縣不同區域的地理微環境可對浮紅香氣物質種類和含量產生一定的影響，進而影響其品質特征，進一步需擴大樣本并結合分子感官科學技術探討其差異機理。

圖2 浮梁紅茶的揮發性組分種類Fig.2 Types of volatile components in Fuliang black tea

2.3 浮梁紅茶揮發性物質的OAV分析

揮發性物質對工夫紅茶特征風味的貢獻不僅與該物質在茶湯中的質量濃度有關，其閾值也是非常重要的參考依據[21]。OAV是香氣化合物質量濃度與閾值的比值，可以表明單一揮發性物質對風味的貢獻度。一般認為OAV不小于1的化合物為呈香的重要物質[22]。通過對73種揮發性成分中已明確閾值的查詢與計算，發現其中15種揮發性成分的OAV不小于1，結果見表2。15種揮發性成分的OAV在10以上的由高到低依次為香葉醇、α-紫羅酮、芳樟醇、苯乙醛和水楊酸甲酯；OAV在1到10之間的由高到低依次為苯甲醇、香葉基丙酮、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、檸檬醛、2-甲基吡嗪和2-正戊基呋喃；OAV在部分樣品中OAV不小于1的由高到低依次為香葉基丙酮、二氫芳樟醇、苯乙醇、反式-橙花叔醇和正己醛。

表2 浮梁紅茶中主要香氣化合物的閾值與氣味活度值Table 2 Threshold values and OAV of main aroma compounds in Fuliang black tea

香葉醇在浮紅中含量最高，其閾值相對較低（40 μg/kg），所以其OAV最高，前人研究結果表明香葉醇是祁門紅茶、大吉嶺紅茶、信陽紅、滇紅及安吉紅茶的重要香氣成分[6,23?24]；α-紫羅酮在浮紅中含量中等，但其閾值極低（2.6 μg/kg），所以OAV相對較高，α-紫羅酮在Kangra正統紅茶、碧螺春和青磚茶中均是重要香氣成分[6]；芳樟醇、苯乙醛和水楊酸甲酯均是信陽紅、滇紅的重要香氣成分[6]。2-正戊基呋喃、檸檬醛、二氫芳樟醇、正己醛在其他工夫紅茶中的OAV小于1[20]，但在浮紅中OAV大于1。此外這些重要香氣成分來源于不同的香氣前體，其中香葉醇、水楊酸甲酯、苯甲醇、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）和苯乙醇的香氣前體物質為糖苷；芳樟醇的香氣前體物質為糖苷和類胡蘿卜素；α-紫羅酮、香葉基丙酮、反式-橙花叔醇的香氣前體物質為類胡蘿卜素；苯乙醛和2-甲基吡嗪來源于美拉德反應[25?27]。

因OAV是單一物質在水溶液中人們能夠識別到的最低濃度，但在茶湯中存在大量的代謝產物，物質之間存在復雜的協同、加和、抑制等交互作用[28]。因此在篩選關鍵呈香物質時，需進一步結合多元統計分析方法，明確各重要揮發性成分的貢獻度。

2.4 浮梁紅茶關鍵呈香物質分析

在分子感官科學中建立的變量之間往往有一定的相關關系，當兩個變量之間有一定相關關系時，可以解釋為這兩個變量反映此問題的信息有一定的重疊[30]。主成分分析是對于原先提出的所有變量，將重復或交互的變量刪去多余，建立盡可能少的新變量，使得這些新變量是兩兩不相關的，而且這些新變量在反映問題的信息方面盡可能保持原有的信息[31]。因此主成分分析能夠應用在分子感官科學中篩選關鍵風味物質。

對浮紅中15種香氣活度值大于1的揮發性成分進行主成分分析，結果見圖3和圖4，主成分分析中提取了前2個主成分，累計貢獻率達到100%，其中主成分1的累計貢獻率達到94%，主成分2的累計貢獻率為6%。在圖3中，大橢圓（R2=1.0）表示100%的解釋方差，小橢圓（R2=0.5）表示50%的解釋方差，如有成分處于小橢圓之內，說明此成分不能被主成分解釋[28]。15個揮發性成分均在大橢圓的邊緣，表示能夠100%解釋，表明這些成分對浮紅的香氣均有貢獻。以各主成分中載荷值在0.9以上的香氣成分作為浮梁紅茶的關鍵呈香物質（圖4），按照載荷值大小依次為檸檬醛、苯甲醇、香葉醇、α-紫羅酮、反式-橙花叔醇、香葉基丙酮、苯乙醇、水楊酸甲酯、正己醛、芳樟醇和2-甲基吡嗪等11種，其中香葉醇、芳樟醇、苯乙醇的香氣類型主要為甜香，玫瑰花香等，檸檬醛、正己醛、α-紫羅酮、香葉基丙酮和水楊酸甲酯的香氣類型為果香、木香等，2-甲基吡嗪為典型的焙烤香。此結論與浮紅的香氣特征描述（香氣芬芳馥郁持久，有明顯的甜香，有時帶有玫瑰花香[2]）相近。

圖3 浮梁紅茶主要香氣成分主成分分析載荷圖Fig.3 Load chart of PCA of main aroma components in Fuliang black tea

圖4 浮梁紅茶主要香氣成分主成分分析的載荷值Fig.4 Load value of PCA of main aroma components in Fuliang black tea

3 結論

采用HS-SPME-GC-MS方法從選用的浮梁紅茶樣品中共鑒定到73種揮發性成分，總量均值為7899.32 μg/kg，以醇類含量最高，其次為酯類、醛類、酸類、酮類、碳氫化合物類、酚類及其衍生物和雜環類，其中，29種成分在樣品之間存在顯著性差異（P<0.05）。揮發性成分中對浮梁紅茶香氣風味呈正相關的有57種、有負相關的有16種，以刺激性的酸類物質為主。15種揮發性成分的OAV大于1，以香葉醇、α-紫羅酮和芳樟醇的最高。使用OAV與PCA綜合篩選出檸檬醛、苯甲醇、香葉醇、α-紫羅酮、反式-橙花叔醇、香葉基丙酮、苯乙醇、水楊酸甲酯、正己醛、芳樟醇和2-甲基吡嗪等11種為浮梁紅茶的關鍵呈香物質。本研究初步明確了浮梁紅茶的揮發性香氣組分與關鍵呈香物質，后續將進一步使用分子感官科學與代謝組學相結合解析浮梁紅茶的特征性風味品質及其香氣物質前體。